茶樹EGCG-O-甲基轉移酶的純化及酶學性質

呂海鵬，張 悅，費冬梅，林 智*

(中國農業科學院茶葉研究所，國家茶產業工程技術研究中心，浙江 杭州 310008)

近年來，茶葉中的甲基化兒茶素成分因其有顯著的抗氧化、抗衰老、抗過敏等功效引起了科研工作者的關注；目前已在相關資源篩選[1-2]、基因克隆[3-4]以及生物活性評價[5-6]等方面取得了很大的研究進展。然而，甲基兒茶素的天然資源十分有限，只有極少數的茶樹品種中的甲基兒茶素含量在1%以上[7-9]，加之由化學合成途徑獲得甲基兒茶素相對困難。因此，為了開發利用這種天然功能成分，甲基兒茶素的酶學合成更具有重要的研究意義[10-11]。

在酶學合成方面，筆者所在的研究團隊在前期的研究過程中，首先研究了重組大腸桿菌內EGCG-O-甲基轉移酶(EOMT)的誘導表達條件[12]；繼而分析推斷出EGCG-O-甲基轉移酶催化EGCG后生成的不同類型的EGCG甲基化衍生物[13]；并查明了甲基化衍生物酶促合成的反應條件[14]；但在實驗過程中發現，EGCG-O-甲基轉移酶粗酶液的比活力很低，致使甲基化兒茶素的得率也比較低；因此，十分有必要對該酶進行分離純化從而提高其催化活性。

本研究擬在上述研究基礎之上，進一步開展EGCG-O-甲基轉移酶的分離純化研究，并查明其酶學特性，以期獲得純度較高、活性較強的EGCG-O-甲基轉移酶。該結果將有助于研究甲基化EGCG的酶學合成技術從而實現后續較大規模的甲基化兒茶素的酶法制備，也有助于進一步研制開發甲基兒茶素相關的新型功能食品和天然藥物等。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

基因重組茶樹EGCG-O-甲基轉移酶的大腸桿菌工程菌由本實驗室構建和保存[12]。宿主菌(感受態細胞)E.coli BL21(DE3)購自北京全式金生物技術有限公司。

鎳離子螯合柱(HisTMTrapHP) 美國GE Healthcare Bio-Science AB公司；蛋白質分子質量標準 美國Bio-Rad公司；Bug Buster Master Mix菌體裂解液 美國Novagen公司；咪唑、牛血清白蛋白、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG，純度≥98%)、氨芐青霉素(Amp)、瓊脂粉 阿拉丁試劑(上海)有限公司；S-腺苷-甲硫氨酸對甲苯磺酸鹽(SAM)、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG) 美國Sigma公司；蛋白胨、酵母提取物 英國Oxoid公司。

Waters 2489-2690高效液相色譜儀 美國Waters公司；Buchi R-210旋轉蒸發儀 瑞士Buchi公司；BS-1E振蕩培養箱 金壇市環宇科學儀器廠；Eppendorf 5810R冷凍離心機 德國Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 重組茶樹EGCG-O-甲基轉移酶的制備

1)取1μL重組質粒加入剛剛融化的表達感受態細胞BL(21)DE3中，輕輕混勻，冰上孵育30min；42℃熱激1min，置于冰上3～5min后均勻涂布于LB固體培養基(Amp+)上，37℃培養過夜。2)從平板中挑取單克隆于100mL液體培養基中，在37℃、200r/min培養約5～7h，使菌液生長至對數期；按1%的接種比例接種于新的10瓶500mL LB液體培養基，繼續37℃、200r/min培養至菌液生長至對數前期約4h；加入IPTG溶液使其終濃度達到50mmol/L，20℃、150r/min培養誘導蛋白表達。3)將過夜誘導的菌液于4℃、5000r/min離心收集菌體；將得到的約20g菌體保存于－80℃冰箱；4)取10g菌體，用50mL磷酸緩沖液混勻，－20℃冷凍1h，超聲溶解菌體，如此反復3次后于4℃，5000r/min離心10min，收集上清液作為粗酶液用于純化。

1.2.2 重組茶樹EGCG-O-甲基轉移酶的純化

1)將粗酶液用注射器通過0.45μm濾膜，除去其中的菌體殘骸及其他雜質。2)蛋白層析柱用純水清洗5個體積，而后再用磷酸緩沖液平衡5個體積。3)上樣，攪拌均勻，放置4h(期間0.5h攪拌一次)。4)采用梯度法開始洗脫，咪唑濃度分別為0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500mmol/L，并將沒有結合的蛋白丟棄。5)收集各個濃度咪唑洗脫液所得。6)對收集的各管洗脫液進行A280nm比色，以磷酸緩沖液做空白，保留吸光度大于零的洗脫液。7)對A280nm的各洗脫液組分進行SDS-PAGE電泳，確定目的蛋白的位置和洗脫液咪唑濃度。8)將較純的目的蛋白各組分合并，繼而用磷酸緩沖液透析以除去咪唑。

1.2.3 蛋白分子質量和濃度的測定

采用Laemmli法進行SDS-PAGE測定蛋白質分子質量；采用Lowry法，以牛血清蛋白為標準測定蛋白質濃度。

1.2.4 酶活力測定

取1mL酶液加入15mL反應液(含2mmol/L MgCl2和DTT、0.4mmol/L SAM、0.3mmol/L EGCG)，于35℃水浴中反應1h，加入0.2mL 1mol/L鹽酸終止反應。加入25mL乙酸乙酯萃取離心，取乙酸乙酯層真空旋轉蒸發濃縮干燥后，用1.0mL水溶出，再加入0.5mL水潤洗后混勻，HPLC檢測甲基化兒茶素的生成量，以此生成量表示酶活力。1個酶活力單位是指在35℃反應條件下，1min內甲基供體SAM向底物EGCG轉移1μmol甲基(－CH3)所需的酶量。

HPLC分析條件參照文獻[14-15]進行。色譜柱：Waters Sunfire C18(4.6mm×250mm，5μm)；流動相A為2%冰乙酸，流動相B為乙腈，流速為1mL/min，柱溫40℃，檢測波長280nm，進樣量10μL，梯度洗脫，流動相B在25min內由12%線性梯度變化到25%，25.5min回到初始狀態，平衡10min。

1.2.5 重組茶樹EGCG-O-甲基轉移酶的酶學性質測定

1.2.5.1 最適反應溫度

在pH7.5時，測定不同反應溫度(25、30、35、40、45、50℃)條件下EGCG-O-甲基轉移酶活力，確定其最適反應溫度。

1.2.5.2 最適反應pH值

在溫度為35℃時，測定不同pH值(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)條件下EGCG-O-甲基轉移酶活力，確定其最適反應pH值。

1.2.5.3 酶的動力學常數

在最適反應溫度和最適pH值條件下，以EGCG為底物，分析測定EGCG-O-轉移酶的動力學常數；用Lineweaver-Burk雙倒數法繪出1/[V]-1/[S]直線，其斜率是Km/Vmax，在縱軸上的截距為1/Vmax，橫軸上的截距為－1/Km。

2 結果與分析

2.1 重組茶樹EGCG-O-甲基轉移酶的鎳離子螯合柱親和純化

由圖1可知，當洗脫液中的咪唑濃度為10～30mmol/L時，有部分雜質蛋白被洗脫下來，說明在純化的起始過程中，可先用濃度為30mmol/L的咪唑洗脫液去除大腸桿菌體內以及反應體系中可能存在的一些原有的雜蛋白；當洗脫液中的咪唑濃度為40～90mmol/L時，無蛋白質被洗脫出來，說明大部分雜蛋白可能已洗脫干凈；當洗脫液中咪唑濃度大于100mmol/L時，目的蛋白開始被洗脫出來，當咪唑濃度為200mmol/L時，目的蛋白被大量洗脫出來；此外，當洗脫液中咪唑濃度為300～500mmol/L時也有少量的目的蛋白被洗脫出來。可見，在純化EGCG-O-甲基轉移酶的過程中，可采用梯度洗脫的方法進行洗脫。100～300mmol/L咪唑對應的泳道中雜蛋白含量已經很少(箭頭所示為目的蛋白)，說明此濃度范圍純化效果較好，可獲得高純度的EGCG-O-甲基轉移酶；經分析檢測，酶的純度超過95%，分子質量約為27.6kD。

圖 1 0～500mmol/L的咪唑洗脫蛋白的SDA-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE analysis of protein eluted by PBS with 0 — 500 mmol/L imidazole

表 1 重組茶樹EGCG-O-甲基轉移酶的純化結果Table 1 Summary of purification of recombinant tea EGCG-Otransferase

重組茶樹EGCG-O-甲基轉移酶的純化結果見表1，采用鎳離子親和層析可以實現對重組茶樹EGCG-O-甲基轉移酶的快速純化，得到純度較高的EGCG-O-甲基轉移酶的酶蛋白。

2.2 重組茶樹EGCG-O-甲基轉移酶的酶學性質

2.2.1 最適反應溫度

分別測定重組茶樹EGCG-O-甲基轉移酶在25～50℃條件下的酶活力，考察EGCG-O-甲基轉移酶催化反應的最佳溫度。以酶活力最高值為100%，對不同溫度作圖，結果見圖2。EGCG-O-甲基轉移酶的最適反應溫度在35℃左右。

自發現O-甲基轉移酶以來，已從植物中直接分離純化或經基因克隆獲得了多種O-甲基轉移酶，通過研究其酶學性質發現O-甲基轉移酶的最適反應溫度在35℃左右，最適pH值在6.5～8.0之間。比如Noriko等[16]從荷蘭鳶尾中克隆表達的2種咖啡酸-O-甲基轉移酶，并發現其最適溫度為35℃，最適pH值為7.5～8.0；Wang等[17]研究表明仙女扇(Clarkia breweri)中的丁香酚-O-甲基轉移酶最適溫度為35℃，最適pH值為7.5。

圖 2 溫度對EGCG-O-甲基轉移酶活力的影響Fig.2 Effect of temperature on tea EGCG-O-transferase activity

2.2.2 最適反應pH值

預實驗結果表明，當緩沖液pH值小于6.0時，向反應體系中加入EGCG-O-甲基轉移酶后，反應體系會迅速變渾濁，經HPLC檢測未發現任何新物質生成，這表明當pH值小于6.0時，EGCG-O-甲基轉移酶會發生失活。實驗分別測定重組茶樹EGCG-O-甲基轉移酶在pH6.0～8.5條件下的酶活力，考察EGCG-O-甲基轉移酶催化反應的最適pH值。以酶活力最高值為100%，對不同 pH值作圖，結果見圖3。該酶的最適反應pH值為7.5。此結果與Noriko[16]、Wang[17]等的研究結果基本一致。

圖 3 pH值對EGCG-O-甲基轉移酶活力的影響Fig.3 Effect of pH on tea EGCG-O-transferase activity

2.2.3 酶動力學參數的確定

在最適反應溫度35℃和最適pH 7.5條件下，以EGCG作為底物，測定酶反應的反應速率，用Lineweaver-Burk雙倒數法作圖。由圖4可知，其回歸方程為：y = 0.0134x +0.1336(R2=0.9943)， EGCG-O-甲基轉移酶的Km值為0.100mmol/L，Vmax為7.485mg/(L·min)。Km值的大小表示酶對底物親合力的大小，Km越小表明酶對底物的親合力越強。

圖 4 雙倒數法測定EGCG-O-甲基轉移酶的米氏常數Fig.4 Km determination of tea EGCG-O-transferase by doublereciprocal plot

3 結 論

重組茶樹EGCG-O-甲基轉移酶經過HisTMTrap親和層析純化后，可得到純度超過95%的重組融合蛋白，純化倍數為22.51倍，酶活回收率為34.54%，酶比活力達到0.0186U/mg，酶分子質量約為27.6kD。

酶學性質測定結果表明，該酶的最適反應溫度為3 5 ℃，最適p H 值為7.5；以EGCG作為反應底物，得到Lineweaver-Burk雙倒數線性回歸方程為y= 0.0134x+0.1336(R2=0.9943)，Km為0.100mmol/L，Vmax為7.485mg/(L·min)。

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