牦牛奶酪中乳酸菌的分離鑒定及發酵性能分析

楊吉霞，陳芝蘭，楊海燕，黃艾祥，陳宗道，賀稚非,*

(1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.重慶市農產品加工技術重點實驗室，重慶 400715；3.西藏農牧學院科研處生物技術中心，西藏 林芝 860000；4.新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052；5.云南農業大學食品科學與技術學院，云南 昆明 650201)

牦牛是一種能夠在寒冷和缺氧的高原環境中生存的動物，中國大約有1300萬頭，占世界總數的90%以上[1]，分布于青海、西藏、四川、甘肅、新疆和云南地區[2]。每頭哺乳期牦牛產奶量為147～487kg[1]，其營養成分比普通牛奶高，含有16.9%～17.7%固形物、4.9%～5.3%蛋白質、5.5%～7.2%脂肪、4.5%～5.0%乳糖、0.8%～0.9%礦物質，普通牛奶含有大約13.3%固形物、3.4%蛋白質、4.0%脂肪、4.8%乳糖、0.7%礦物質[1,3]。高原牧民將牦牛奶制作成奶酪，是一種重要的延長奶食用期限的方式，幾千年來牧民很好地保持了用原料奶或者容器中的天然乳酸菌發酵的傳統，一方面，不同地域的自然環境和氣候、不同的原料奶以及不同的加工工藝，造成了不同奶酪中乳酸菌菌種構成的差異，可能存在菌種的多樣性，另一方面，在長期生產實踐中，奶酪中的乳酸菌可能積累了某些優良的發酵性能，如果能發掘出其中的優良乳酸菌，將有助于豐富工業發酵菌種，改變菌種同質化嚴重的現狀。

本研究分別采用表型和基因型方法鑒定牦牛奶酪中的乳酸菌，以探討乳酸菌的構成情況。一般來說，綜合運用表型和基因型方法，是鑒定乳酸菌、獲得全面的基礎數據的最佳方式。乳酸菌對于奶酪質構和風味的形成起著關鍵的作用，可分為發酵菌和非發酵菌(non-starter lactic acid bacteria，NSLAB)，發酵菌的主要作用是產酸，使酪蛋白凝固，非發酵菌產酸弱但耐酸能力強，在奶酪成熟過程中，產生酶(主要是蛋白酶)裂解蛋白質而影響奶酪的質構，或者與形成風味的前體物質有關[4]，此外，乳酸菌產胞外多糖的活性也受到一些學者的關注，因為胞外多糖既可以作為酸奶發酵中的增稠劑，改變乳的流變特性，也有免疫調節等生理功能[5-6]。本研究對菌株的產酸活性、產蛋白酶、利用檸檬酸鹽、產胞外多糖等發酵性能進行分析，以篩選有優良發酵性能的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集

奶酪樣品采集自西藏、云南、新疆3個省區17戶牧民家庭，西藏樣品4個(rkz、yzy、nd、mls)，云南樣品5個(3-1、3-3、3-4、3-5、6-1)，新疆樣品8個(2#、4#、8#、9#、10#、22#、44#、77#)。將奶酪樣品用無菌操作裝入無菌采樣袋中(NASCOB00679WA)，冷藏運輸到實驗室。

1.1.2 試劑

乳酸菌表型鑒定所用的培養基和試劑參照文獻[7-9]中的方法配制；石蕊牛奶培養基 美國BD公司；BBLTM、API?50CHL 生物梅里埃中國有限公司。分子生物學實驗用的緩沖液和常備試劑按照文獻[10]中的方法配制。Taq酶(5U/μL)、dNTPs(10mmol/L)、10×酶緩沖液、MgCl2(25mmol/L) New England Bio Labs公司；100bp DNA Ladder 美國Promega公司；瓊脂糖、溶菌酶、蛋白酶K、EDTA-Na2、Tris-base、Guanidine Thiocyanate 美國Fisher Scientific公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.3 標準菌株

Lactobacillus casei ATCC 393；Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469和Lactobacillus plantarum ATCC 8014購自青島綠谷商貿有限公司。

1.2 儀器與設備

S1000系列高性能PCR儀、164-5050電泳儀 美國Bio-Rad公司；Syngene Gene Genius凝膠成像系統 美國基因有限公司；Biospec-mini型DNA/RNA/蛋白質分析裝置 島津中國有限公司；HB031型金屬恒溫加熱器 上海博彩生物科技有限公司；SIM-F140AY65型制冰機 日本三洋有限公司；1-15PK型臺式離心機 德國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的pH值檢測、菌落計數和分離純化乳酸菌

取10g奶酪樣品，用90mL 0.9%生理鹽水(pH7.0)均質，測pH值，然后做10倍系列稀釋，10-1、10-2、10-3、10-4共4個稀釋度各取1mL，用平板涂布法接種于MRS培養基，37℃厭氧培養48h，測菌落總數，設3個重復。根據形態特征挑選菌落，用MRS培養基劃線分離至純菌株，將革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶陰性的菌株初步選為乳酸菌。將純化后的菌株分別于－20℃和－80℃冷凍保藏。

1.3.2 乳酸菌菌種鑒定

1.3.2.1 表型鑒定

參照文獻[8-9]的方法，做屬的鑒定實驗：產芽孢、運動性、硝酸鹽還原反應、H2S產生、明膠液化、生成吲哚、精氨酸產氨、發酵葡萄糖產氣；菌株在不同的NaCl質量濃度(4、6.5、8g/100mL)、不同pH值(3.9、4.5、9.6)、不同溫度(10、15、45℃)條件下的生長特性；石蕊牛奶實驗，并判斷出菌屬。

用API?50CHL檢測菌株的碳水化合物發酵模式，根據API的判讀結果，并參照文獻[8-9]的標準判斷菌種。

1.3.2.2 基因型鑒定

用16S rRNA序列分析法進一步驗證菌種：用文獻[11]所述異硫氰酸胍法提取乳酸菌基因組DNA，用引物27fF (5’-AGAGTTT GAT(C/T)(A/C)TGGCTCAG-3’)和S-G-Lab-0677-R(5’-CACCGCTACACATGGAG-3’)做PCR擴增[12]，25μL反應體系為：2.5μL 10×酶緩沖液(無Mg2+)，2.5μL(25mmol/L)MgCl2，0.5μL dNTPs，0.2μL(10μmol/L)引物，0.2μL Taq DNA酶，50ng模板DNA，加超純水至25μL，反應程序為：94℃預變性3min；94℃、30s，55℃、30s，72℃、40s，30次循環；72℃延伸7min，目標產物約為700bp。產物送生工生物工程(上海)股份公司測序。將菌株序列輸入GenBank數據庫中做同源序列搜索，用MEGA 5軟件包將待測菌株與模式菌株的序列以Clustal W進行比對，用UPGMA(unweighted pair-group method with arithmetic means)法進行1000次Bootstrap檢驗后構建系統發育樹。一般來講，在種分類等級上，如果2個分類單位間的16S rRNA序列同源性大于97.5%，則認為屬于同一個種[13]，對于同源性低于97.5%的菌株采用種特異性PCR驗證，或結合表型鑒定方法判斷菌種。

L.casei 種特異性PCR：用引物5’-TGCAC TGAGATTCGACTTAA-3’和Y2(5’-CCCACTGC TGCCTCCCGTAGGAGT-3’)進行PCR擴增[14]，反應體系和反應程序如前所述，采用標準菌株Lactobacillus casei ATCC393和Lactobacillus rhamnosus ATCC7469；Lactobacillus plantarum ATCC8014分別作為陽性和陰性對照，目標片段長度約290bp。

1.3.3 乳酸菌發酵性能分析

1.3.3.1 菌株產酸活性

將活化后的菌株按體積分數1%接種到11g/100mL的脫脂牛奶中(110℃滅菌10min)，初始pH值為6.6，37℃厭氧培養，分別于6h和24h取樣測可滴定酸，用0.1mol/L NaOH滴定，酚酞作為指示劑，以乳酸的百分比表示結果[15]。

1.3.3.2 菌株利用檸檬酸鹽的能力

根據Kempler等[16]的方法檢測，能夠利用檸檬酸鹽的菌落是深藍色的(普魯氏藍)，不能利用檸檬酸鹽的菌落保持白色。

1.3.3.3 菌株prt P基因

參照文獻[1 7-1 8]用引物P 6(5’-C A A C A CGGCATGCATGTTGC-3’)和P7(5’-CTGGCGTTCCCACCA TTCA-3’)做PCR擴增，反應體系和反應程序如前所述，目標片斷為393bp。該目標片斷與菌株合成蛋白酶相關，故可用于產蛋白酶菌株的初步篩選。

1.3.3.4 菌株產胞外多糖的活性

配制釕紅牛奶培養基[19]：0.5g/100mL酵母提取物、10g/100mL脫脂乳粉、1g/100mL蔗糖、1.5g/100mL瓊脂、1g/100mL葡萄糖，110℃滅菌10min，待溫度降至約50℃，用0.22μm濾膜過濾除菌加入釕紅(終質量濃度0.08g/L)，混勻后倒平板。將菌株用劃線法接種，37℃培養72h，產胞外多糖的菌株不被釕紅染色，仍為白色或乳白色菌落。對于篩選出的陽性菌株，參照文獻[20-21]分離提取胞外多糖，用苯酚-硫酸法[22]測菌株胞外多糖產量，葡萄糖標準曲線為y=0.0067x－0.0149(R2=0.9958)。

2 結果與分析

2.1 樣品的菌落計數、pH值和分離純化的乳酸菌

表 1 各地牦牛奶酪樣品的pH值、菌落計數及分離純化出的乳酸菌Table 1 pH and colony enumeration of yak milk cheese samples and isolated strains from each sample

如表1所示，西藏、云南、新疆3個地區菌落計數平均值分別為4.17±0.43、4.30±0.68、3.90±0.59(lg(CFU/g))，pH值平均值分別為4.31±0.39、4.69±0.29、4.52±0.22，地區之間不存在顯著性差異(菌落計數P=0.468＞0.05；pH值P=0.176＞0.05)。與酸奶中乳酸菌的數量(6～8(lg(CFU/mL)))相比，奶酪中乳酸菌的數量較低，可能是因為在除去乳清、腌漬和成熟后，奶酪中的水分活度下降，而且奶酪有一定的含鹽量，多數pH＜5.0，這些因素都不利于乳酸菌的生長。

2.2 乳酸菌的鑒定

2.2.1 表型鑒定

39株乳酸菌主要的生理生化特性列于表2。其中有35株菌在顯微鏡下的形態為桿狀，芽孢、運動性、硝酸鹽還原、H2S實驗(與丹毒絲菌屬相區分)均為陰性；在pH4.5的環境中生長(與肉食桿菌屬相區分)，符合乳桿菌屬的特征。4株菌(T5、Y11、Y14、Y17)在顯微鏡下的形態為成對或四聯狀球菌，芽孢、運動性、硝酸鹽還原實驗均為陰性，不產生H2S或吲哚、在6.5g/100mL NaCl或者pH4.5 MRS培養基中生長、在pH9.6中不生長，在45℃能生長、能水解精氨酸產氨、不能發酵葡萄糖產CO2，符合片球菌屬的特征。從樣品中分離出的球菌種類和數量很少，可能與奶酪的水分活度低，pH值較低，致使耐酸性差的球菌生長受到抑制，到發酵后期很難存活有關。

對于35株乳桿菌用API50CHL檢測了碳水化合物發酵模式，參照文獻[8-9]將主要的發酵模式歸納于表3中。經過API LAB Plus對結果的判讀，35株乳桿菌被分為7個菌種：L. buchneri 2株、L. casei 16株、L. diolivorans 3株、L. fermentum 3株、L. helveticus 3株、L. kefiri 3株和L. plantarum 5株，結果見表2。

值得指出的是，所有35株乳桿菌在15℃都能生長，但是根據文獻[8] L. fermentum和L. helveticus在15℃不生長，其原因可能是菌株經過長期適應高原地區相對低溫氣候環境，形成了這種在廣泛溫度范圍內生長的特性，說明被分離菌株的適應能力增強。

2.2.2 分子生物學鑒定

39株菌用部分16S rRNA序列(V1～V3區)分析法鑒定菌種。35株乳桿菌的鑒定結果與表型鑒定結果是一致的，其中25株菌序列同源性≥99%，4株菌(T6、T7、Y10、Y13)為98%，6株菌低于97.5%：T15(97%)、Y18(96%)、Y19(95%)、X21(94%)、X26(97%)、X29(94%)。其中Y19、X21、X26和X29用種特異性PCR進一步驗證為L. casei(圖1)。

4株球菌也用部分16S rRNA序列分析法鑒定出菌種，序列同源性均高于97.5%。T5為P. acidilactici，Y11、Y14和Y17為P. pentosaceus。

表 2 牦牛奶酪中乳酸菌的主要生理生化特性Table 2 Primary biochemical and physiological characteristics of isolated strains from yak milk cheeses

圖 1 L.casei種特異性PCR鑒定結果Fig.1 Profi le of PCR amplicons with L. casei species specifi c primers

圖 2 用乳酸菌16S rRNA序列構建的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree originated from partial 16S rRNA sequences of lactic acid bacteria isolates.

系統進化樹(圖2)顯示了不同菌種之間清晰的分類關系。L. casei、L. plantarum、L. diolivorans、L. fermentum和L. helveticus的菌株完全按照菌種各自聚為一類，L. buchneri和L.kefi ri組的聚類稍有偏差，Y15和Y10沒有歸在相應的組里，球菌Y14、Y17也沒有歸在P. pentosaceus組內，可能是因為與模式菌株的序列同源性比較低。39株菌的序列數據都提交到GenBank，注冊號為JN836453～JN836491。

表 3 API 50CHL測出的牦牛奶酪中乳桿菌的碳水化合物發酵模式Table 3 Carbohydrate fermentation patterns of isolated lactobacilli by API 50CHL

2.2.3 乳酸菌菌株按地區的分布情況

表 4 各地區乳酸菌菌株的分布情況Table 4 Regional distribution of identified lacticacid bacteria from yak milk cheeses

由表4可知，從云南地區樣品分離出的乳酸菌中共鑒定出7個菌種，多樣性最為豐富，其次為西藏地區樣品(鑒定出5個菌種)，從新疆樣品中僅鑒定出3個菌種。新疆樣品乳酸菌主要是L. casei為優勢菌種。

2.3 乳酸菌的發酵性能

2.3.1 乳酸菌的產酸活性

通過測39株菌在11g/100mL脫脂牛奶中培養6h和24h時可滴定酸(圖3)分析乳酸菌的產酸活性。培養6h時，可滴定酸的范圍是0.24%～1.08%，培養24h時的范圍是0.63%～2.19%，產酸活性最強的是X24(L. diolivorans)。國外文獻[17]將6h可滴定酸值大于0.6%作為篩選產酸能力強的乳酸菌的標準，本實驗中有8株菌滿足這一條件：X24、X38、X29、X25、X21、X22、X30、X35。

圖 3 菌株在11g/100mL脫脂牛奶中培養6h和24h后的可滴定酸Fig.3 Titratable acidity of 11 g/100 mL non-fat dry milk after incubation with each isolate for 6 h and 24 h

一般來說，乳桿菌屬大多屬于非起酵菌種(non-starter lactic acid bacteria)(L. delbrueckii 和L. helveticus中的嗜熱菌種除外)，產酸活性不強[4]。在本實驗中，有少數乳桿菌產酸活性達到了發酵菌種的水平，可能是由于在長期生產過程中積累而成的優良特性。

2.3.2 利用檸檬酸鹽

乳酸菌發酵檸檬酸鹽的活性與風味前體物質雙乙酰的形成有關，因此可以影響奶酪的風味和香味[16]。39株菌中有23株能發酵檸檬酸鹽(表2)，其中T4、T7、Y10、Y13、X25、X28、Y36、Y37利用檸檬酸鹽的能力比較強。

2.3.3 prt P基因篩選

圖 4 乳酸菌prt P基因擴增結果Fig.4 Prt P gene amplifi cation results obtained from LAB isolates

10株菌prt P基因擴增陽性(圖4)：T7、Y19、X21、X22、X23、X26、X28、X29、X30、X34，即這些菌株能產生蛋白水解酶。乳酸菌的蛋白酶用于降解酪蛋白和多肽，產生大量的自由氨基酸，從而影響奶酪的質構和風味[4,17]。

2.3.4 產胞外多糖

9株菌產胞外多糖(圖5)：T3、T4、T5、T7、T8、Y11、Y14、Y17、X29。胞外多糖產量如表5所示，產量最高的菌株是T8，為(193.00±1.75)mg/L。

圖 5 釕紅平板培養基篩選產胞外多糖的乳酸菌Fig.5 Colony on ruthenium red milk plates with or without exopolysaccharide-producing capability

表 5 乳酸菌胞外多糖產量Table 5 Exopolysaccharide yield of selected lactic acid bacteria

3 結 論

3.1 本研究從西藏、云南、新疆采集了17份自然發酵的牦牛奶酪，用MRS培養基菌落計數平均值分別為4.17±0.43、4.30±0.68、3.90±0.59(lg(CFU/g))，pH值平均值分別為4.31±0.39、4.69±0.29、4.52±0.22，地區之間不存在顯著性差異(菌落計數P=0.468＞0.05；pH值P=0.176＞0.05)。

3.2 從17份牦牛奶酪樣品中，用表型和基因型相結合的方法鑒定出39株乳酸菌，其中乳桿菌35株，分別為L. buchneri 2株、L. casei 16株、L. diolivorans 3株、L. fermentum 3株、L. helveticus 3株、L. kefiri 3株和L. plantarum 5株，片球菌4株，分別為P. acidilactici 1株、P. pentosaceus 3株。乳桿菌占總菌株89.7%，為優勢菌屬。

3.3 從各地區的菌株分布情況來看，云南樣品乳酸菌共有7個菌種，多樣性最為豐富，其次為西藏樣品乳酸菌(鑒定出5個菌種)，新疆樣品乳酸菌僅有3個菌種，主要是L. casei為優勢菌種。

3.4 通過測菌株在11g/100mL脫脂牛奶中37℃培養6h和24h后的可滴定酸，篩選出8株菌X24、X38、X29、X25、X21、X22、X30、X35產酸活性較強，有可能作為發酵菌種。

3.5 菌株T7在檸檬酸鹽利用、prt P基因擴增和產胞外多糖活性實驗中結果均為陽性，有可能作為非發酵菌種，在奶酪成熟過程中對風味質地的形成產生影響。

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