脂肪酶在尼龍網上的固定化及其酶學性質研究

趙 磊，唐 婧，王成濤*

(北京工商大學 食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京市食品風味化學重點實驗室，北京 100048)

脂肪酶(EC3.1.1.3)，即三酰基甘油酰基水解酶，它能在油水界面上催化酯水解和醇解、酯合成、酯交換、內酯合成及高聚物合成等有機合成反應，是目前被重點研究的酶催化劑[1]。脂肪酶廣泛應用于食品工業、藥物合成、農用化學品工業、油脂化學品工業、日用化學工業以及洗滌和生物表面活性劑的合成等各種生物技術領域[2]。已有文獻報道采用脂肪酶催化合成乳化劑(糖酯)、表面活性劑、蠟酯及芳香酯等重要的工業產品[3]。

游離酶在工業生產中常表現出低的生物活性和穩定性，這在很大程度上限制了酶在工業中的應用[4]。這些缺點往往可通過酶的固定化克服。與游離酶相比，通常固定化酶有著較高的溫度、pH值及操作穩定性[5]。硅藻土、離子交換樹脂等顆粒狀物質是廣泛使用的固定化酶載體[6-7]。顆粒狀固定化酶雖然具有許多優越特性并可經過濾回收使用，但仍存在一些問題限制其大規模使用，如：1)通常高成本，2)在兩相系統中經攪拌容易破碎[6]，3)不能用于固定床反應器[8-9]。目前，作為替代球狀載體的海綿狀、纖維狀、膜狀、蜂窩狀等片狀載體已在工業生產上開發應用[10-11]。尼龍結構類似多肽，經部分酸水解活化后產生游離氨基和羧基，可通過戊二醛與酶共價結合[12]，對酶具有保護作用，而且生產成本低廉、無毒、穩定性良好、易獲得。已有報道[13-17]成功將脲酶、葡萄糖氧化酶、糖化酶、堿性蛋白酶等固定于尼龍網上，并對其固定化后的酶學性質及穩定性進行了研究。然而，對脂肪酶在尼龍網上固定化的研究較少，僅黎春怡等[18]對固定化豬胰脂肪酶條件進行了優化，但尚未對其固定化后的酶學性質及穩定性進行研究。此外，微生物脂肪酶比動物脂肪酶具有更廣的作用pH值和溫度范圍，并且便于進行工業生產而更具優越性。

本研究以尼龍網作為載體，戊二醛為交聯劑，采用共價交聯對微生物脂肪酶(Candida sp. 99-125)進行固定化，并研究固定化條件和固定化酶的酶學性質及穩定性。以期為尼龍網固定化脂肪酶的工業化應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

假絲酵母脂肪酶(Candida sp. 99-125) 北京化工大學譚天偉教授惠贈；尼龍網(200目)、橄欖油 國藥集團化學試劑北京有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Scientz-IID型超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；ALC-1100.2分析天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司；數顯電子恒溫水浴鍋 金壇市至翔科教儀器廠；PHS-3D pH計 上海三信儀表廠；HZS-H水浴振蕩器 哈爾濱東聯電子技術開發有限公司。

1.3 方法

1.3.1 載體的處理與脂肪酶的固定化

剪取1cm×1cm的尼龍，將尼龍膜浸入18.6g/100mL CaCl2-18.6%水的甲醇溶液10min，輕輕攪拌，洗凈晾干，后在4mol/L的HCl中水解40min，使膜邊緣卷曲，水洗至中性，晾干。將處理好的膜在一定體積分數的戊二醛磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中交聯適當時間，用pH7.0的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3～4次以除去未反應的戊二醛，晾干，得固定化膜載體。

精確稱取酶粉，用0.1mol/L的PBS配成一定質量濃度酶液。將膜載體(1cm×1cm)浸潤在酶液中，4℃放置一定時間，PBS液洗脫至洗脫液在280nm波長處無光吸收，得固定化脂肪酶，并將其在4℃條件下保存。

1.3.2 脂肪酶活力測定[19]

分別移取5mL 0.025mol/L磷酸緩沖液(pH7.0)和4mL聚乙烯醇橄欖油乳化液，置于40℃水浴中保溫5min，然后加入脂肪酶，繼續保溫15min，取出立即加入95%乙醇15mL，以停止酶作用，再加酚酞指示劑3滴，用0.05mol/L氫氧化鈉滴定至溶液呈粉紅色為止。對照組先不加酶液，也繼續保溫15min后，立即取出，各加入15mL 95%乙醇，然后再加入脂肪酶。

聚乙烯醇橄欖油乳化液的制備：稱取40g聚乙烯醇，加蒸餾水約1L，在小火上加熱，并不停攪拌，至聚乙烯醇全部溶解，冷卻后定容至1L。用雙層紗布過濾，濾液備用。取4%聚乙烯醇溶液150mL，加50mL橄欖油，超聲處理6min，即成乳白色聚乙烯醇橄欖油乳化液，保存于4℃備用。

酶活力以國際單位表示，即在一定條件下，脂肪酶水解脂肪每分鐘產生1μmol脂肪酸的酶量定為一個國際單位。

式中：V樣品為樣品消耗堿液體積/mL；V對照為對照組消耗堿液體積/mL；c為堿液濃度/(μmol/mL)；f為稀釋倍數；t為作用時間/min。

1.3.3 酶學性質的測定

1.3.3.1 最適溫度

將游離酶或固定化酶加入底物溶液(pH7.0)中，于不同溫度下(30～60℃，間隔5℃進行變化)進行反應，其他步驟同脂肪酶活力測定。分別以游離酶和固定化酶的最高活力為100%，進行數據處理。

1.3.3.2 熱穩定性

取游離酶或固定化酶置于0.1mol/L，pH7.0的PBS緩沖液中，靜置于恒溫箱(30、35、40、45、50、55、60℃)中，20min后取出，測定酶活力。分別以游離酶和固定化酶的最高活性為100%，進行數據處理。

1.3.3.3 半衰期(t1/2)

固定化酶的使用穩定性常用t1/2表示，即固定化酶活力下降為最初活力一半所經歷的連續工作時間。根據Arrhenius公式：

式中：at為t時刻酶的活力/(U/cm2)；a0為0時刻酶的活力/(U/cm2)；Kd為衰減常數。

當溫度一定時，以ln(at/a0)對時間t作圖為直線，其斜率為－Kd。一定溫度下酶的半衰期為：t1/2=0.693/Kd。本實驗采用聚乙烯醇橄欖油乳化液作為底物，取一定量游離酶和固定化酶，放入pH7.0的磷酸鹽緩沖溶液中50℃保溫，間隔一定時間取出測定其酶活，并依據公式(2)求出半衰期。

1.3.3.4 最適pH值

將游離酶或固定化酶置于pH值為2.0～10.0的不同pH值緩沖液配制的底物溶液中，于40℃進行反應，其他步驟同脂肪酶活力測定。分別以游離酶和固定化酶的最高活性為100%，進行數據處理。

1.3.3.5 pH值穩定性

取游離酶或固定化酶，分別于pH值為2.0～10.0的磷酸鹽緩沖溶液中40℃溫育2h后，取出酶測定其活性，其他步驟同脂肪酶活力測定。分別以游離酶和固定化酶的最高活性為100%，進行數據處理。

1.3.3.6 操作穩定性

以橄欖油為底物，pH7.0的磷酸鹽緩沖溶液為溶劑，取面積為10cm2的固定化脂肪酶作為催化劑，在40℃、搖床轉速為150r/min條件下水解反應15min，測定其初始酶活后用磷酸鹽緩沖溶液沖洗干凈，并拭干水分后重復使用，通過考察酶殘留活性隨使用次數的變化，研究酶的操作穩定性。

1.3.3.7 脂肪酶反應動力學常數測定

用聚乙烯醇橄欖油乳化液作為底物，取一定量游離酶和固定化酶，選用不同底物濃度在40℃、pH7.0條件下測定酶促反應初速率，用雙倒數作圖(Lineweaver-Burk)法求出相對應的Km及Vmax。

由式(3)可知1/[V]和1/[S]呈線性關系，故以1/[V]對1/[S]作圖得一直線，根據其斜率及縱軸截距即可求得反應動力學常數Km及Vmax。

2 結果與分析

2.1 酶的固定化條件

2.1.1 戊二醛體積分數對固定化酶活力的影響

圖 1 戊二醛體積分數(A)、交聯時間(B)、脂肪酶質量濃度(C)和固定化時間(D)對脂肪酶固定化的影響Fig.1 Effects of glutaraldehyde concentration (A), cross-linking time (B), lipase concentration (C) and immobilization time (D) on activity of immobilized lipase

作為一種交聯劑，戊二醛能夠與載體和酶上的—NH2基團反應，從而在酶分子內部以及酶與載體之間形成化學鍵[20]。由圖1A可知，隨著戊二醛體積分數的增加固定化酶活力很快的上升。當交聯劑戊二醛體積分數到達3%時，酶活力到達最大值3.50U/cm2，并且趨于穩定。故后續實驗選用3%戊二醛為宜。

2.1.2 交聯時間對固定化酶活力的影響

由圖1B可知，戊二醛可迅速地與酶分子上的—NH2基團進行反應。在反應初始階段，反應速度非常快，并在60min時固定化酶活力達到最大值。隨后，由于參與反應過程的—NH2基團數量不再發生變化，繼續延長交聯時間至180min，對提高固定化脂肪酶活力無顯著影響。故后續試驗中戊二醛交聯時間以60min為宜。

2.1.3 脂肪酶質量濃度對固定化酶活力的影響

由圖1C可知，在尼龍網上的結合位點飽和前，隨著脂肪酶質量濃度(≤10mg/mL)的增加固定化酶活力也隨之增加。當脂肪酶質量濃度到達10mg/mL時，尼龍網上的結合位點達到飽和，脂肪酶活力達到最大值3.57U/cm2，并達到平穩狀態，繼續增加脂肪酶質量濃度并不能提高固定化酶活力。因此，后續試驗中選擇10mg/mL質量濃度酶液進行固定化。

2.1.4 固定化時間對固定化酶活力的影響

由圖1D可知，當固定化時間為1h時，固定化酶活力幾乎為零。隨著固定化時間的延長，單位酶活力也逐漸增大，當固定化時間到達6h，酶活力達到最大值(3.33U/cm2)，并趨于平穩。這表明，固定化時間達到6h時尼龍網上的酶結合活性位點達到飽和。因此，后續實驗中固定化時間以6h為宜。

2.2 固定化酶的酶學性質

2.2.1 最適溫度

圖 2 游離酶和固定化酶的最適溫度(A)和溫度穩定性(B)Fig.2 Effects of temperature on the activity (A) and stability (B) of free and immobilized lipase

由圖2A可知，游離酶的最適溫度為45℃，而固定化酶的最適溫度為50℃。該脂肪酶固定化后最適溫度升高，這可能是由于載體的保護作用，使酶在固定化后對熱變性作用不敏感。當溫度低于45℃時，游離酶的酶活力高于固定化酶，這可能與酶固定化到載體上后產生分子擴散阻力及構象改變有關。當溫度高于50℃時，游離酶和固定化酶的酶活力均顯著下降，這可能由于隨著溫度的升高，聚集的酶分子被打開最終使其失去活性。酶固定化后最適溫度升高的現象在固定化酶中普遍存在[21-23]。

2.2.2 溫度穩定性

游離酶和固定化酶分別置于不同溫度保溫20min，然后測定酶活力。由圖2B可知，該酶置于30℃存放20min后的酶活力較45℃存放時降低的多，分析原因可能是該酶屬于冷不穩定酶，這類酶在較低溫度條件下易于失活，這大多是由于它們在較低溫度易于解離成亞基。該結果與Ding Liang[24]和Kandasamy[25]等報道的相似。與游離酶相比，固定化酶可以在更高的溫度下保持其活性。這表明，固定化酶的熱穩定性得到了顯著提高。在60℃，固定化酶仍保持其初始酶活力的40%，而游離酶活力僅殘余4%。這主要是由于脂肪酶經固定化后，載體結構對酶分子起到保護作用，并且載體與酶、酶與酶之間的位點交聯降低了酶結構對溫度的敏感性，使酶構象不易伸展失活。同時，固定化減少了酶分子內部基團的熱震動，增加了酶結構對溫度變化的耐受能力，故有效降低了酶活力因外界溫度變化帶來的影響。

2.2.3 半衰期t1/2

圖 3 游離酶和固定化酶的半衰期曲線Fig.3 Half-life curves of free and immobilized lipase

t1/2是用于描述酶熱穩定性的另一重要參數。由圖3可知，隨著時間的延長，固定化酶活力逐漸下降，根據斜率求得固定化酶在50℃時的半衰期為239min。與之相比，游離酶活力隨時間的增加迅速下降，根據斜率求得游離酶在50℃時的半衰期為24min。固定化酶的半衰期是游離酶的9.86倍，其穩定性明顯高于游離酶。這與酶與載體之間形成共價鍵，從而阻止酶在較高溫度下的構象變化有關[26-27]。

2.2.4 最適pH值

圖 4 游離酶和固定化酶的最適pH值(A)和酸堿穩定性(B)Fig.4 Effects of pH on the activity (A) and stability (B) of free and immobilized lipase

圖4A顯示了游離酶和固定化酶的最適pH值，游離酶和固定化酶的最適pH值均為7.0，脂肪酶經固定化后其最適pH值并未發生變化，但固定化酶在pH 5.0～7.0的范圍內均保持非常高的活性，這可能與載體尼龍提供的微環境保護作用有關。由于與載體的靜電相互作用，通常使固定化酶的微環境和主體溶液氫離子和氫氧根離子濃度分配不同，從而其pH值譜圖產生位移[28-29]。通常，當酶固定在陰離子載體上時，其最適pH值一般向堿性一側移動，反之則向酸性一側移動[30]。

2.2.5 pH值穩定性

由圖4B可知，固定化酶活力隨pH值變化改變緩慢，并較游離酶有著較好的pH值穩定性。在pH5.0～7.0范圍內，游離酶可以保持其初始酶活力的90%以上；相比之下，固定化脂肪酶對pH值變化不敏感，可在更寬的pH值范圍內(pH3.0～9.0)保持90%以上的初始酶活。當pH值為10.0時，固定化酶酶活力僅降低24%，而游離酶酶活力卻降低了58%；當pH值為2.0時，固定化酶活力僅降低39%，而游離酶活力卻降低了54%。酶經固定化后可以顯著提高其pH值穩定性已被廣泛證實[31-32]。

2.2.6 操作穩定性

圖 5 固定化酶的操作穩定性Fig.5 Operation stability of immobilized lipase

經過反復實驗，測試固定化脂肪酶水解橄欖油的操作穩定性，結果見圖5。在連續使用5個批次后固定化酶仍保持73%的初始酶活力。重復使用一次后，固定化脂肪酶活力較初始值降低了21%，并在后續4次使用后保持不變。經5次使用后酶活力的降低可能與酶從基質上泄漏或固定化基質表面形成乳狀液薄膜有關[33]。該固定化酶表現出了良好的操作穩定性，這對于高效率地利用催化劑，降低操作成本有著重要意義。

2.2.7 酶促反應動力學常數

圖 6 游離酶和固定化酶的Lineweaver-Burk曲線Fig.6 Lineweaver-Burk plots of free and immobilized lipase

游離酶和固定化酶水解橄欖油的Lineweaver-Burk曲線如圖6所示，線性回歸系數分別為0.973和0.995。經計算得出，游離酶和固定化酶的米氏常數(Km值)分別為0.21mol/L和0.57mol/L；最大反應速率(Vmax)分別為0.34×10-4mol/(L·s)和0.29×10-3mol/(L·s)。固定化酶的表觀Km和Vmax均高于游離酶。表觀米氏常數Km所反映出的是酶與底物的親和能力，Km越小說明酶與底物親和能力越強。結果顯示，游離酶的Km小于固定化酶，說明游離酶對底物的親和力要優于固定化酶。這主要是因為酶經固定化后，載體的存在增大了酶周圍的空間位阻，加大了底物與載體上酶蛋白分子活性中心的結合阻力，故降低了底物與酶的親和能力，故Km值升高。與Km的結論不同，固定化酶最大反應速率Vmax遠大于游離酶。說明要達到同樣的催化效果，固定化酶所需時間要短于游離酶。

3 結 論

以尼龍網為載體、戊二醛為交聯劑，脂肪酶(Candida sp. 99-125)最適固定化條件為：戊二醛體積分數3%、交聯時間60min、脂肪酶質量濃度10mg/mL、固定化時間6h。

與游離酶相比，固定化酶的最適溫度從45℃提高至50℃，最適pH值相同，均為7.0，并在pH5.0～7.0范圍內均有非常高的活力。脂肪酶經固定化后，其熱穩定性、pH值穩定性、最大反應速率均得到了一定程度的提高。固定化酶的Km值為0.57mol/L，高于游離酶的Km值(0.21mol/L)，與底物親和力略有降低。經過5次重復操作使用后，固定化酶的活力仍保持在80%左右，具有良好的操作穩定性。

利用化學性質穩定，成本低廉的尼龍網固定脂肪酶，操作簡便、易于保存，而且酶的穩定性良好，利用率高，為工業化應用脂肪酶奠定了基礎。

[1] DOSANJH N S, KAUR J. Immobilization stability and esterifi cation studies of a lipase from a Bacillus sp.[J]. Biotechnol Appl Biochem, 2002, 36(1)： 7-12.

[2] SHARMA R, CHISTI Y, BANERJEE U C. Production, purifi cation, characterization and applications of lipases[J]. Biotechnol Adv, 2001, 19： 627-662.

[3] KRISHNA S H, KARANTH N G. Lipase and lipase-catalyzed esterifi cation reactions in non-aqueous media[J]. Catal Rev-Sci Eng, 2002, 44： 499-591.

[4] YI?ITO?LU M, TEMO?IN Z. Immobilization of Candida rugosa lipase on glutaraldehyde-activated polyester fi ber and its application for hydrolysis of some vegetable oils[J]. J Mol Catal B-Enzym, 2010, 66： 130-135.

[5] ODIAN G G. Principles of polymerization[M]. New York： John Wiley & Sons Inc., 2004： 770.

[6] DENG Li, TAN Tianwei, WANG Fang, et al. Enzymatic production of fatty acid alkyl esters with a lipase preparation from Candida sp. 99-125[J]. Eur J Lipid Sci Tech, 2003, 105： 727-734.

[7] MONIER M, El-SOKKARY A M A, SARHAN A A. Immobilization of Candida rugosa lipase on modified natural wool fibers[J]. Funct Polym, 2010, 70： 122-128.

[8] LEI Jie, FAN Jie, YU Chengzhong, et al. Immobilization of enzymes in mesoporous materials： controlling the entrance to nanospace[J]. Micropor Mesopor Mat, 2004, 73： 121-128.

[9] HUANG Lei, CHENG Zhenmin. Immobilization of lipase on chemically modifi ed bimodal ceramic foams for olive oil hydrolysis[J]. Chem Eng J, 2008, 144： 103-109.

[10] CENTI G, PERATHONER S. Novel catalyst design for multiphase reactions[J]. Catal Today, 2003, 79-80： 3-13.

[11] BARTOLINI M, CAVRINI V, ANDRISANO V J. Monolithic micro-immobilized-enzyme reactor with human recombinant acetylcholinesterase for on-line inhibition studies[J]. J Chromatogr A, 2004, 1031： 27-34.

[12] SUNDARAM P V, HORNBY W E. Preparation and properties of urease chemically attached to nylon tube[J]. FEBS Lett, 1970, 10： 325-327.

[13] AMAYA-DELGADO L, HIDALGO-LARA M E, MONTESHORCASITAS M C. Hydrolysis of sucrose by invertase immobilized on Nylon-6 microbeads[J]. Food Chem, 2006, 99： 299-304.

[14] CHELLAPANDIAN M, SASTRY C A. Immobilization of alkaline protease on nylon[J]. Bioproc Biosyst Eng, 1994, 11： 17-21.

[15] INMAN D J, HORNBY W E. The immobilization of enzymes on nylon structures and their use in automated analysis[J]. Biochem J, 1972, 129： 255-262.

[16] PAHUJANI S, KANWAR S S, CHAUHAN G, et al. Glutaraldehyde activation of polymer Nylon-6 for lipase immobilization： enzyme characteristics and stability[J]. Bioresource Technol, 2008, 99： 2566-2570.

[17] MILLER E. Immobilization of glucoamylase on polyamide nets[J]. Acta Biotechnol, 1998, 18： 135-146.

[18] 黎春怡, 曾萍, 董利, 等. 尼龍固定化豬胰脂肪酶的條件優化[J]. 輕工科技, 2012(8)： 26-27.

[19] 李建武. 生物化學實驗原理和方法[M]. 北京： 北京大學出版社, 1994.

[20] WATANABE N, OTA Y, MINODA Y, et al. Isolation and identifi cation of alkaline lipase producing microorganisims, cultural conditions and some properties of crude enzyme[J]. Agric Biol Chem, 1977, 41： 1353-1358.

[21] SPAGNA G, ANDREANI F, SALATELLI E, et al. Immobilization of α-L-arabinofuranosidase on chitin and chitosan[J]. Process Biochem, 1998, 33： 57-62.

[22] ELNASHAR M M M, YASSIN M A, KAHIL T. Novel thermally and mechanically stable hydrogel for enzyme immobilization of penicillin G acylase via covalent technique[J]. J Appl Polym Sci, 2008, 109： 4105-4111.

[23] ELNASHAR M M M, DANIAL E N, AWAD G E A. Novel carrier of grafted alginate for covalent immobilization of inulinase[J]. Ind Eng Chem Res, 2009, 48： 9781-9785.

[24] DING Liang, YAO Zihua, LI Tong, et al. Study on papain immobilization on a macroporous polymer carrier[J]. Turk J Chem, 2003, 27(5)： 627-637.

[25] KANDASAMY R, KENNEDY L J, VIDYA C, et al. Immobilization of acidic lipase derived from Pseudomonas gessardii onto mesoporous activated carbon for the hydrolysis of olive oil[J]. J Mol Catal B-Enzym, 2010, 62： 69-66.

[26] WANG Zhengang, KE Beibei, XU Zhikang. Covalent immobilization of redox enzyme on electrospun nonwoven poly(acrylonitrileco-acrylic acid) nanofiber mesh filled with carbon nanotubes： a comprehensive study[J]. Biotechno Bioeng, 2007, 97： 708-270.

[27] HUANG Xiaojun, CHEN Pengcheng, HUANG Fu, et al. Immobilization of Candida rugosa lipase on electrospun cellulose nanofi ber membrane[J]. J Mol Catal B-Enzym, 2011, 70： 95-100.

[28] WANG Qiang, FAN Xuerong, HU Yingjun, et al. Antibacterial functionalization of wool fabric via immobilizing lysozymes[J]. Bioproc Biosyst Eng, 2009, 32(5)： 633-639.

[29] KURIMOTO A, TANABE T, TACHIBANA A, et al. Keratin sponge： immobilization of lysozyme[J]. J Biosci Bioeng, 2003, 96： 307-309.

[30] COSTA S A, TZANOV T, PAAR A, et al. Immobilization of catalases from Bacillus SF on alumina for the treatment of textile bleaching effl uents[J]. Enzyme Microb Tech, 2001, 28： 815-819.

[31] KHARRAT N, ALI Y B, MARZOUK S, et al. Immobilization of Rhizopus oryzae lipase on silica aerogels by adsorption： comparison with the free enzyme[J]. Process Biochem, 2011, 46： 1083-1089.

[32] ABDEL-NABY M A, SHERIF A A, Ei-TANASH A B, et al. Immobilization of Aspergillus oryzae tannase and properties of the immobilized enzyme[J]. J Appl Microbiol, 1999, 87： 108-114.

[33] FJERBAEK L, CHRISTENSEN K V, NORDDAHL B. A review of the current state of biodiesel production using enzymatic transesterifi cation[J]. Biotechnol Bioeng, 2009, 102： 1298-1315.