黑曲霉H1-9b發(fā)酵產(chǎn)葡萄糖氧化酶的工藝優(yōu)化

唐 菁，趙 芯，蘇 茉，唐云明*

(西南大學生命科學學院，三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，重慶 400715)

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)是一種需氧脫氫酶，它能利用分子氧作為電子受體，專一催化β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和過氧化氫[1]。這種酶廣泛應用于工業(yè)、食品加工、釀酒[2]及醫(yī)藥衛(wèi)生行業(yè)[3-5]。葡萄糖氧化酶在工業(yè)生產(chǎn)中多以黑曲霉(Aspergillus niger)、點青霉 (Penicilliun notatun)等微生物為主要來源[6]。表面活性劑具有乳化和分散的作用，在發(fā)酵過程中可以改善氣液表面的狀態(tài)以及發(fā)酵液流動性的功能，也具有改變細胞膜通透性的功能。本實驗篩選獲得一株葡萄糖氧化酶的高產(chǎn)菌株，黑曲霉H1-9b(20U/mL)，與Petruccioli等[7]研究得出的5.49U/mL和Khattab等[8]測得的最大酶活力15.9U/mL相比，該菌株在產(chǎn)酶能力上有較大優(yōu)勢。本實驗以黑曲霉H1-9b為出發(fā)菌株，采用單因素和正交設計優(yōu)化發(fā)酵條件，并通過向培養(yǎng)基中添加表面活性劑，提高單位體積發(fā)酵液的葡萄糖氧化酶產(chǎn)量，以期為工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

菌種為本實驗室分離保藏的菌株黑曲霉H1-9b[9]。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：察氏(Czapek)培養(yǎng)基[10]；發(fā)酵培養(yǎng)基：采用本實驗室優(yōu)化后的培養(yǎng)基，即含葡萄糖80g/L、蛋白胨2g/L、NaNO35g/L、KH2PO40.7g/L、KCl 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.6g/L，pH值自然。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)

活化培養(yǎng)：挑1環(huán)孢子接種于斜面培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96h。

孢子懸液制備：取活化的斜面培養(yǎng)的1支，加入無菌水洗下孢子，制成孢子懸液，采用血細胞計數(shù)法調(diào)整孢子濃度為106個/mL。

發(fā)酵培養(yǎng)：250mL的三角瓶中裝入50mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，于28℃搖床上200r/min振蕩培養(yǎng)78h。

1.3.2 粗酶液制備

1.3.2.1 菌絲體粗酶液制備

搖床發(fā)酵培養(yǎng)完成后，用紗布過濾發(fā)酵液，收集球狀菌絲體，用雙蒸水將其反復沖洗，直至把發(fā)酵液沖洗干凈；再用0.2mol/L pH5.7的磷酸緩沖液沖洗菌絲體，壓干水分，稱質(zhì)量。將菌絲體置于研缽中，加入適量石英砂，對菌體進行研磨；充分研磨后按1：1(m/V)加入預冷的0.05mol/L pH5.7的磷酸緩沖液浸酶，4℃抽提2h。抽提完成后在4℃、12000r/min的條件下離心20min，取上清，于4℃保存。

1.3.2.2 發(fā)酵液粗酶液制備

發(fā)酵液先用兩層紗布過濾，濾液冷凍離心，條件為4℃、10000r/min離心15min，取上清，于4℃保存。

1.3.3 酶活力測定參照文獻[4,11]的方法并加以改進，取適當稀釋后酶液50μL，加入2.0mL 0.1mol/L pH5.7的磷酸緩沖溶液、0.3mL 10%葡萄糖溶液、50μL 16mmol/L 4-氨基安替吡啉、50μL 7.5mmol/L苯酚、50μL 1000U/mL的過氧化物酶，在37℃條件下，準確反應4min，再置于沸水浴中快速滅活4min，冷卻至室溫，在500nm波長處測定其吸光度；用預先滅活的酶液作空白對照，其他處理條件相同。酶活力單位(U)定義為：每分鐘消耗1μmol葡萄糖所需要的酶量為1個活力單位。

1.3.4 蛋白質(zhì)的含量

采用紫外分光光度法[12]測定蛋白質(zhì)含量。

1.3.5 菌體干質(zhì)量測定[13]

將經(jīng)兩層紗布過濾后的菌絲體，用蒸餾水沖洗2次，于55℃烘箱中干燥至質(zhì)量恒定后稱質(zhì)量。

1.3.6 不同發(fā)酵條件對產(chǎn)酶的影響[14]

1.3.6.1 轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶的影響

以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎，裝液量為250mL三角瓶中發(fā)酵液50mL，接種200μL孢子懸液，搖床轉(zhuǎn)速設定為1～4組，分別為150、200、250、300r/min，28℃振蕩培養(yǎng)78h。每組處理設3個重復。

1.3.6.2 初始pH值對產(chǎn)酶的影響

用0.1mol/L的HCl溶液和0.1mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)，使發(fā)酵液初始pH值為3～8，0.5為1個pH值間隔，各組pH值重復3次。搖床轉(zhuǎn)速為250r/min，28℃振蕩培養(yǎng)78h。

1.3.6.3 接種量對產(chǎn)酶的影響

以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎，接種量設定為10、50、100、150、200、250、300μL孢子懸液，每組水平重復3次。初始pH4.5，裝液量為250mL三角瓶中發(fā)酵液50mL，搖床轉(zhuǎn)速為250r/min，28℃振蕩培養(yǎng)78h。

1.3.6.4 裝液量對產(chǎn)酶的影響

設定250mL三角瓶中所含的發(fā)酵液為20、40、50、60、80、100、120、140mL，每組水平重復3次。接種量為250μL孢子懸液，搖床轉(zhuǎn)速為250r/min，28℃振蕩培養(yǎng)78h。

1.3.6.5 表面活性劑對產(chǎn)酶的影響

向基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0.5%的吐溫-20、吐溫-80和Triton X-100來考察表面活性劑種類對產(chǎn)酶的影響。搖床轉(zhuǎn)速為250r/min，28℃振蕩培養(yǎng)78h。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 11.5軟件進行數(shù)據(jù)處理，參考文獻[15]的方法。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵條件的優(yōu)化研究

2.1.1 轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶的影響

黑曲霉為專性好氧菌，孢子的萌發(fā)、菌體的繁殖和酶的合成都需要氧氣。三角瓶中的發(fā)酵液在搖床上振蕩，產(chǎn)生氣液的混合和分散，使空氣中的氧有效地溶解。因此，搖床轉(zhuǎn)數(shù)影響菌體的生產(chǎn)和酶的產(chǎn)量。由圖1可知，最適轉(zhuǎn)速為200r/min。若轉(zhuǎn)速低于200r/min，由于通氧差，產(chǎn)酶量降低；隨著轉(zhuǎn)速的增加，剪切力增大而影響菌體生長，產(chǎn)酶量也隨之下降。

圖 1 轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effect of rotation speed on glucose oxidase production

2.1.2 初始pH值對產(chǎn)酶的影響

圖 2 初始pH值對產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of initial pH on glucose oxidase production

初始pH值會影響菌的代謝途徑和生長速率[16]，從而影響菌的生長和酶的合成。黑曲霉在pH1.5～9.0的范圍內(nèi)都能生長[17]。由圖2可知，黑曲霉H1-9b在初始pH值為3～8的范圍內(nèi)都能生長，最適pH值為4.5。當初始pH＞7時，黑曲霉H1-9b基本貼壁生長；當初始pH＜4.5時，這由于菌代謝產(chǎn)酸，進一步降低發(fā)酵液pH值，影響跨膜pH值梯度，引起菌體膜滲透性的變化，從而影響菌對養(yǎng)分的吸收和代謝產(chǎn)物的分泌，導致產(chǎn)酶量不高。

2.1.3 接種量對產(chǎn)酶的影響

圖 3 接種量對產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of inoculum amount on glucose oxidase production

接種量影響菌生長達到高峰的時間，從而影響產(chǎn)物的合成。由圖3可知，接種量為250μL時，其酶活力最高。接種量＜100μL時產(chǎn)酶量較低，可能原因是菌絲體生長過慢，需要較長的發(fā)酵時間才能達到最大菌絲生物量，從而影響了產(chǎn)酶量；接種量＞250μL時，產(chǎn)酶量也隨之降低，可能是由于菌體生長過快，發(fā)酵液黏度增加，導致溶氧不足，影響葡萄糖氧化酶的合成。

2.1.4 裝液量對產(chǎn)酶的影響

裝液量的多少直接影響溶氧水平，從而影響菌生長和產(chǎn)酶。由圖4可知，當裝液量為80、100、120mL時，酶活力較高。當裝液量為140mL時，酶活力降低，這主要是因為隨著裝液量的增加，體積溶氧系數(shù)降低，導致黑曲霉生長所必需的氧供應不足，從而導致產(chǎn)酶量降低。

圖 4 裝液量對產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of broth amount on glucose oxidase production

2.1.5 正交試驗[18]優(yōu)化發(fā)酵工藝

選用L9(34)設計正交試驗，對接種量、裝液量、初始pH值以及轉(zhuǎn)速這4個因素進行優(yōu)化，見表1，初始pH值是影響搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖氧化酶的最主要因素，而影響搖瓶發(fā)酵的最小因素為接種量。A1B2C2D1為最佳組合，即轉(zhuǎn)速200r/min、初始pH5.3、接種量200μL孢子懸液、裝液量80mL。

表 1 正交試驗設計及結果Table 1 Design and results of orthogonal tests

2.2 表面活性劑對產(chǎn)酶的影響

2.2.1 表面活性劑種類對產(chǎn)酶的影響

表面活性劑一方面具有改善細胞膜通透性，減少氧及營養(yǎng)物質(zhì)進入細胞的傳遞阻力，加快物質(zhì)傳遞運輸?shù)哪芰Γ涣硪环矫鎸ξ⑸镉卸拘院蜌⒕饔肹19]。黑曲霉H1-9b產(chǎn)的葡萄糖氧化酶為胞內(nèi)酶，考慮通過添加表面活性劑促使酶釋放，從而提高發(fā)酵液中葡萄糖氧化酶的含量，達到提高總酶活力的目的。由圖5可知，3種表面活性劑對產(chǎn)酶都有促進作用，其中吐溫-80對產(chǎn)酶的促進作用最強。因此選用吐溫-80作進一步研究。

圖 5 表面活性劑對產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of surfactant type on glucose oxidase production

2.2.2 吐溫-80添加量對產(chǎn)酶的影響

由圖6可知，吐溫-80添加量為0時，酶活力為28.60U/mL；隨著吐溫-80添加量的增高，產(chǎn)酶的促進效果也增強；當添加量為3%時，酶活力達到68.96U/mL，約提高了1.4倍。可能原因是添加量達到3%之前，細胞膜和細胞壁的通透性隨著添加量的增高而逐漸增大，在3%附近，菌體產(chǎn)酶達到最大值。添加量繼續(xù)增大，過大的細胞膜和細胞壁通透性會影響菌體細胞的正常生命活動。因此，選擇吐溫-80添加量為3%。

2.3 發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響

圖 7 黑曲霉H1-9b的產(chǎn)酶曲線Fig.7 Production curve of glucose oxidase

由圖7可知，黑曲霉H1-9b在培養(yǎng)3d時，達到產(chǎn)酶高峰，之后酶活力緩慢下降，因此發(fā)酵時間應為3d左右。

3 討 論

影響黑曲霉產(chǎn)葡萄糖氧化酶的因素很多，在液體發(fā)酵狀態(tài)下培養(yǎng)基的組成、發(fā)酵條件等都是重要因素。本實驗室已經(jīng)研究不同發(fā)酵培養(yǎng)基對黑曲霉H1-9b的產(chǎn)酶影響(未發(fā)表)；在此基礎上，本研究對發(fā)酵條件進行了正交試驗優(yōu)化；之后向培養(yǎng)基添加3%吐溫-80以提高葡萄糖氧化酶產(chǎn)量。優(yōu)化后的發(fā)酵條件為：接種量200μL孢子懸液、裝液量80mL、初始pH5.3、轉(zhuǎn)速200r/min。這時所獲得的葡萄糖氧化酶總酶活力最高可達28.60U/mL；當在培養(yǎng)基中添加3%吐溫-80后，酶活力提高到68.96U/mL，是未添加吐溫-80發(fā)酵產(chǎn)酶量28.60U/mL的2.4倍，是文獻[8]報道的4倍。通過發(fā)酵動力學曲線得知，黑曲霉H1-9b的發(fā)酵時間應為3d左右。

本研究通過添加表面活性劑吐溫-80[20]的方法，顯著提高了酶產(chǎn)量。這對小規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)更多的酶有一定的參考價值。使用吐溫-80具有以下優(yōu)點：屬于非離子表面活性劑，對菌體的毒性最小；是水溶性長鏈脂肪酸的酯類物質(zhì)，可影響微生物細胞的膜通透性[20]及發(fā)酵液的乳化性和分散性，使葡萄糖氧化酶釋放到發(fā)酵液中；分泌到胞外的葡萄糖氧化酶更適合于工業(yè)化大生產(chǎn)和獲得高純度樣品，因為胞外酶收集方便，發(fā)酵液中蛋白質(zhì)種類較細胞內(nèi)部少，從而可以降低后續(xù)純化難度，故可考慮將此方法應用于小規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，同時也為今后研究大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)工藝提供一定的參考。

[1] HATZINIKOLAOU D G, HANSEN O C, MACRIS B J, et al. A new glucose oxidase from Aspergillus niger： characterization and regulation studies of enzyme and gene[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 1996, 46： 371-381.

[2] PICKERING G J. Optimising glucose conversion in the production of reduced alcohol wine using glucose oxidase[J]. Food Research International, 1998, 31(10)： 685-692.

[3] SANDIP B B, MAHESH V B, REKHA S S, et al. Glucose oxidase： an overview[J]. Biotechnology Advances, 2009, 27(4)： 489-501.

[4] GROMADA A, FIEDUREK J. Selective isolation of Aspergillus niger mutants with enhanced glucose oxidase production[J]. Journal of Applied Microbiology, 1997, 82(5)： 648-652.

[5] BANKAR S B, BULE M V, SINGHAL R S, et al. Glucose oxidase： an overview[J]. Biotechnology Advances, 2009, 27(4)： 489-501.

[6] FOGARTY W M. Microbial enzymes and biotechnology[M]. London： Applied Science Publishers, 1983： 111-123.

[7] PETRUCCIOLI M, CECCARELLI M, FEDERICI F. Screening of Penicillium species for the production of extracellular glucose oxidase[J]. Springer Netherlands, 1993, 9(1)： 77-79.

[8] KHATTAB A A, BAZARAA W A. Screening, mutagenesis and protoplast fusion of Aspergillus niger for the enhancement of extracellular glucose oxidase production[J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2005, 32(7)： 289-294.

[9] 蘇茉, 高亞鵬, 梁建榮, 等. 黑曲霉H1-9b葡萄糖氧化酶的分離純化及性質(zhì)研究[J]. 食品科學, 2011, 32(3)： 181-185.

[10] 劉峰, 黃鷺強, 林穎, 等. 從土壤中快速篩選葡萄糖氧化酶產(chǎn)生菌及發(fā)酵工藝的優(yōu)化[J]. 生物技術, 2007, 17(3)： 64-68.

[11] 張茜, 傅婉輝, 康勁翔, 等. 青霉葡萄糖氧化酶的分離純化及性質(zhì)研究[J]. 廈門大學學報： 自然科學版, 2009, 48(1)： 100-102.

[12] LAYNE E. Spectrophotometic and turbidimetric methods for measuring proteins[M]//COLEEICK S P, KAPLAW N O. Methods in enzymology. Vol. Ⅲ. New York： Academic Press, 1957： 447-454.

[13] 諸葛健, 李華鐘. 微生物學[M]. 2版. 北京： 科學出版社, 2009： 124-221.

[14] 張婷. Aspergillius niger Z-25產(chǎn)葡萄糖氧化酶發(fā)酵條件優(yōu)化及酶的分離純化研究[D]. 南京： 南京農(nóng)業(yè)大學, 2008.

[15] 郝拉娣, 張嫻, 劉琳. 科技論文中正交試驗結果分析方法的所有[J]. 編輯學報, 2007, 19(5)： 340-341.

[16] 楊斌, 李彤森, 柳成益, 等. 搖床速度、初始接種量和pH值對粉擬青霉生長的影響[J]. 云南大學學報： 自然科學版, 2005, 27(3)： 267-271.

[17] 岑沛霖, 蔡謹. 工業(yè)微生物學基礎[M]. 北京： 化學工業(yè)出版社, 2000.

[18] 李云雁, 胡傳榮. 試驗設計與數(shù)據(jù)處理[M]. 2版. 北京： 化學工業(yè)出版社, 2008： 231.

[19] 陳榮圻. 表面活性劑化學及應用[M]. 北京： 紡織工業(yè)出版社, 1990： 41.

[20] REESE E T, MAGUIRE A. Surfactants as stimulants of enzyme production by microorganisms[J]. Appl Microbiol, 1969, 17： 242-245.