右旋糖苷對(duì)生姜蛋白酶的化學(xué)修飾及其酶學(xué)性質(zhì)影響

張建萍，劉恩岐*，巫永華，陳尚龍

(徐州工程學(xué)院 江蘇省食品資源開(kāi)發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221008)

生姜蛋白酶是繼木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶等之后發(fā)現(xiàn)的一種新的植物蛋白酶，在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上與上述蛋白酶具有很多相似性，被認(rèn)為是木瓜蛋白酶家族的又一新成員。但由于穩(wěn)定性差、失活快，限制了其在生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用[1]。酶分子的化學(xué)修飾是指在分子水平上改造酶蛋白，將酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)與一些化學(xué)基團(tuán)特別是具有生物相容性的大分子進(jìn)行共價(jià)連接，從而改變其酶學(xué)性質(zhì)，以提高酶活力、增強(qiáng)穩(wěn)定性[2]。右旋糖苷是一種天然的大分子多糖，它由D-葡萄糖通過(guò)α-1,6糖苷鍵連接而成，具有良好的生物相容性和水溶性，其糖鏈上的醛基經(jīng)活化后可與酶蛋白分子上的游離氨基共價(jià)結(jié)合[3-4]，是目前應(yīng)用廣泛的酶分子及蛋白質(zhì)修飾劑之一。已有報(bào)道用于修飾堿性蛋白酶[5]、脂肪酶[6]、胭脂魚(yú)胰蛋白酶[7]、Savinase蛋白酶[8]以及花生蛋白[9]等，并取得了較好的修飾效果。本實(shí)驗(yàn)在生姜蛋白酶分離純化的基礎(chǔ)上，以高碘酸鈉活化的右旋糖苷對(duì)生姜蛋白酶進(jìn)行化學(xué)修飾，研究化學(xué)修飾反應(yīng)的最佳條件、修飾效果以及修飾前后的酶學(xué)性質(zhì)變化，為生姜蛋白酶的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮生姜 徐州農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；右旋糖苷(dextran40000) 日本和光純業(yè)工業(yè)株式會(huì)社；高碘酸鈉 天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、亞硫酸氫鈉、硼氫化鈉、碳酸氫鈉、三氯乙酸、十二烷基磺酸鈉(SDS) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Sephadex G-50、二乙氨基乙基纖維素DE-52、三聚氯氰(C3Cl3N3)、2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS) 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

pH計(jì) 梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司；THZ-82型數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；IT-09A-5型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TU-1810紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；Alphal-2LDPLUS型真空冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司；AKTA蛋白純化系統(tǒng) 美國(guó)安瑪西亞公司；Sigma3K30高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 生姜蛋白酶的制備

將1kg洗凈的新鮮生姜切丁，加入2L經(jīng)4℃預(yù)冷的磷酸緩沖液(pH6.0、0.05mol/L)，用高速組織搗碎機(jī)制成勻漿，4000r/min離心20min，棄渣取上清液。將姜液與4℃預(yù)冷的丙酮按體積比1：1混合，12000r/min離心5min，棄上清液，取沉淀真空冷凍干燥，制得生姜蛋白酶粗粉[10]。將生姜蛋白酶粗粉用pH6.0磷酸緩沖液溶解后，采用蛋白純化系統(tǒng)經(jīng)Sephadex G-50和二乙氨基乙基纖維素DE-52分離純化，透析脫鹽后經(jīng)冷凍干燥得到生姜蛋白酶純品[11]。

1.3.2 生姜蛋白酶活力測(cè)定

酶活定義為在50℃、pH6.0條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸為1個(gè)蛋白酶活力單位，按宋琦[12]報(bào)道的方法測(cè)定生姜蛋白酶修飾前后的酶活力(U/mg)，按照式(1)計(jì)算修飾酶的相對(duì)酶活力。

1.3.3 右旋糖苷的活化及其對(duì)生姜蛋白酶的修飾

取1g右旋糖苷溶于10mL蒸餾水，加入1mL質(zhì)量濃度為12g/L的NaIO4溶液，于4℃反應(yīng)18h，再加入質(zhì)量濃度為5g/L的NaHSO3溶液還原過(guò)量的NaIO4，室溫下以蒸餾水透析4h后，再以5L磷酸緩沖液(pH6.0、0.05mol/L)透析16h，濃縮、凍干即得活化右旋糖苷[6,13]。

將活化右旋糖苷以一定的比例加入生姜蛋白酶質(zhì)量濃度為2mg/mL的磷酸緩沖液中，同時(shí)按質(zhì)量濃度為1mg/L加入酪蛋白底物(修飾過(guò)程加入底物保護(hù)酶活性部位可以提高修飾酶的活性)[14]，在一定的條件下進(jìn)行修飾反應(yīng)，然后加入質(zhì)量濃度為50mg/mL的NaBH4溶液終止反應(yīng)，調(diào)pH值至7.0用蒸餾水透析4h，濃縮、凍干即得修飾的生姜蛋白酶[15]。通過(guò)測(cè)定相對(duì)酶活力和酶蛋白氨基修飾率，研究活化右旋糖苷對(duì)生姜蛋白酶的最佳修飾條件。

1.3.4 酶蛋白氨基修飾率的測(cè)定

采用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)法[16]測(cè)定酶蛋白氨基修飾率。酶蛋白表面的游離氨基與過(guò)量的TNBS反應(yīng)，生成三硝基苯酚的衍生物，在335nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，根據(jù)這一原理可以檢測(cè)出蛋白質(zhì)表面殘留的氨基。取質(zhì)量濃度為1mg/mL的生姜蛋白酶液1mL，加入1mL質(zhì)量濃度為4g/L、pH 8.5的碳酸氫鈉溶液和1mL質(zhì)量濃度為10g/L的SDS溶液，20min后加入1mL質(zhì)量濃度為0.1g/L的TNBS溶液，40℃保溫2h，再加入1mol/L的鹽酸0.5mL終止反應(yīng)。335nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。同樣質(zhì)量濃度的酶液在修飾反應(yīng)后與反應(yīng)前吸光度之比即為殘留氨基量，按公式(2)計(jì)算生姜蛋白酶的氨基修飾率。

式中：A1為酶液修飾反應(yīng)前吸光度；A2為酶液修飾反應(yīng)后的吸光度。

1.3.5 生姜蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

以質(zhì)量濃度為1g/L的酪蛋白為底物，測(cè)定不同溫度和pH值條件下天然酶和修飾酶的酶活力(U/mg)，分析比較生姜蛋白酶修飾前后的最適溫度、最適pH值。

將修飾前后的生姜蛋白酶和底物溶液在80℃保溫一定時(shí)間，冷卻至50℃，迅速測(cè)定其酶活性，計(jì)算殘留酶活力。

在最適反應(yīng)溫度和pH值條件下，以酪蛋白為底物，測(cè)定酪蛋白不同質(zhì)量濃度[S] (2～1000μg/mL)條件下，生姜蛋白酶天然酶和修飾酶催化水解酪蛋白的反應(yīng)速率V(亦即酶活力)，以底物質(zhì)量濃度的倒數(shù)1/[S]為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)速率的倒數(shù)1/V為縱坐標(biāo)，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖，推導(dǎo)出反應(yīng)速率與底物質(zhì)量濃度的關(guān)系式即米氏方程式，求出其酶動(dòng)力學(xué)特征參數(shù)：米氏常數(shù)(Km)和最大反應(yīng)速率(Vmax)[17]。

1.3.6 紫外吸收光譜測(cè)定[18]

以pH6.0、0.05mol/L磷酸緩沖液配制生姜蛋白酶的質(zhì)量濃度為0.25mg/mL，測(cè)定其修飾前后的紫外吸收光譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 活化右旋糖苷修飾生姜蛋白酶的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 pH值對(duì)修飾效果的影響

在溫度35℃，生姜蛋白酶與活化右旋糖苷的質(zhì)量比為1：14，pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0條件下修飾3h，終止反應(yīng)，測(cè)其修飾前后的酶活力和氨基殘留量，計(jì)算相對(duì)酶活力和氨基修飾率，結(jié)果見(jiàn)圖1。pH 6.0時(shí)相對(duì)酶活力和修飾率都達(dá)到最大，這一結(jié)果與伍志權(quán)等[18]用右旋糖苷修飾酵母蔗糖酶的研究報(bào)道基本一致，因此選擇pH5.5～6.5進(jìn)一步正交試驗(yàn)。

圖 1 pH值對(duì)活化右旋糖苷修飾生姜蛋白酶的影響Fig.1 Effect of pH on the activity of modifi ed zingibain

2.1.2 溫度對(duì)修飾效果的影響

在pH6.0，生姜蛋白酶與活化右旋糖苷的質(zhì)量比為1：14，溫度分別為25、30、35、40、45℃條件下修飾3h，終止反應(yīng)，測(cè)定計(jì)算其相對(duì)酶活力和氨基修飾率，結(jié)果見(jiàn)圖2。溫度小于40℃時(shí)，修飾酶的相對(duì)酶活力和修飾率隨著溫度升高而升高，之后又開(kāi)始下降，選擇修飾反應(yīng)溫度38～42℃進(jìn)一步正交試驗(yàn)。

圖2 溫度對(duì)活化右旋糖苷修飾生姜蛋白酶的影響Fig.2 Effect of temperature on the activity of modifi ed zingibain

2.1.3 活化右旋糖苷用量對(duì)修飾效果的影響

圖 3 酶與活化右旋糖苷質(zhì)量比對(duì)右旋糖苷修飾生姜蛋白酶的影響Fig.3 Effect of mass ratio of zingibain to activated dextran on the activity of modifi ed zingibain

在pH6.0，溫度40℃，生姜蛋白酶與活化右旋糖苷的質(zhì)量比分別為1：7、1：14、1：21、1：28、1：35的條件下修飾3h，終止反應(yīng)，測(cè)定計(jì)算其相對(duì)酶活力和氨基修飾率，結(jié)果見(jiàn)圖3。隨著活化右旋糖苷用量的增加，修飾率不斷上升，相對(duì)酶活力則在酶與活化右旋糖苷的質(zhì)量比為1：21時(shí)達(dá)到最高，之后又開(kāi)始下降。因此，選擇酶與活化右旋糖苷的質(zhì)量比為1：20～1：22進(jìn)一步正交試驗(yàn)。

2.1.4 修飾時(shí)間對(duì)修飾效果的影響

在溫度35℃、pH7.0，生姜蛋白酶與活化右旋糖苷的質(zhì)量比為1：14的修飾反應(yīng)條件下，分別修飾0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4h，終止反應(yīng)，測(cè)定計(jì)算其相對(duì)酶活力和氨基修飾率，結(jié)果見(jiàn)圖4。隨著修飾時(shí)間的延長(zhǎng)，相對(duì)酶活力和氨基修飾率都逐漸升高，修飾時(shí)間為3h時(shí)達(dá)到最高，之后開(kāi)始下降，這可能是因?yàn)樾揎棔r(shí)間過(guò)短，修飾劑與酶未能充分結(jié)合；修飾時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，修飾反應(yīng)中間產(chǎn)物—吡氯芐氧胺不穩(wěn)定分解所致[14,18]，因此選擇修飾時(shí)間為2.8～3.2h進(jìn)行進(jìn)一步正交試驗(yàn)。

圖 4 修飾時(shí)間對(duì)活化右旋糖苷修飾生姜蛋白酶的影響Fig.4 Effect of modifi cation time on the activity of modifi ed zingibain

2.2 活化右旋糖苷修飾生姜蛋白酶的正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，其設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表1，由極差分析可知，以相對(duì)酶活為修飾效果指標(biāo)時(shí)，各因素的主次順序是：修飾時(shí)間＞酶與活化右旋糖苷的質(zhì)量比＞pH值＞溫度，理論最佳方案為A2B2C3D3；對(duì)理論最佳方案進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果修飾酶的酶活力為291.5U/mg，氨基修飾率為57.8%，與修飾前生姜蛋白酶(酶活力96.2U/mg)相比的相對(duì)酶活力為303.2%，即修飾酶活力約是天然生姜蛋白酶的3.0倍，優(yōu)于試驗(yàn)最佳方案。以修飾率為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，各因素的主次順序?yàn)椋盒揎棔r(shí)間＞酶與活化右旋糖苷的質(zhì)量比＞pH值＞溫度，理論最佳方案為A3B2C2D3；對(duì)理論最佳方案進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果氨基修飾率為75.8%，修飾酶的酶活力為182.8U/mg，約是天然生姜蛋白酶的1.9倍。試驗(yàn)結(jié)果表明，修飾條件各因素對(duì)修飾酶活性和修飾率影響的主次順序一致，但酶蛋白氨基修飾率最高時(shí)修飾酶活力反而有所降低，這是由于水溶性大分子對(duì)酶蛋白的修飾是隨機(jī)的，盡管在底物保護(hù)下酶的活性中心不被破壞，但這種隨機(jī)修飾極有可能修飾到酶活性中心附近或用以維持酶活性天然構(gòu)象的有關(guān)氨基，從而導(dǎo)致酶活性下降[19]。綜合比較，確定右旋糖苷修飾生姜蛋白酶的較佳方案為A2B2C3D3，即修飾時(shí)間3h、pH6.0、溫度42℃，酶與活化右旋糖苷質(zhì)量比為1：22。

表 1 活化右旋糖苷修飾生姜蛋白酶的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 1 Factors and levels of the orthogonal array design L9(34)

表 2 正交試驗(yàn)方差分析Table 2 Orthogonal array design matrix L9(34) and experimental results

將極差分析對(duì)修飾酶相對(duì)酶活和氨基修飾率影響最小的C因素(溫度)作為誤差的估計(jì)值進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表2，以相對(duì)酶活為修飾效果指標(biāo)時(shí)，A因素(修飾時(shí)間)具有顯著影響(P＜0.05)，B因素(pH值)和D因素(酶與活化右旋糖苷質(zhì)量比)對(duì)結(jié)果均無(wú)顯著影響(P＞0.05)；以氨基修飾率為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，修飾時(shí)間、pH值和酶與活化右旋糖苷質(zhì)量比各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果均無(wú)顯著影響(P＞0.05)。單從該方差分析結(jié)果來(lái)看，修飾時(shí)間是唯一對(duì)修飾酶的活性具有顯著性影響的因素，修飾時(shí)間不足，酶蛋白分子氨基修飾率低，達(dá)不到降低酶催化反應(yīng)所需要的化學(xué)能從而提高酶活力的效果，修飾過(guò)度，有可能修飾到酶活性中心附近用以維持酶活性天然構(gòu)象的有關(guān)氨基，反而降低修飾酶的活性。而從正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案層面進(jìn)一步分析，之所以只有修飾時(shí)間為重要影響因素，其他因素的F值均不顯著，是因?yàn)檫@種無(wú)重復(fù)試驗(yàn)的方差分析的誤差是由影響最小的因素一列或空列來(lái)估計(jì)的，誤差自由度過(guò)小，誤差平方和較大，致使各因素的效應(yīng)達(dá)不到顯著水平，所以擬按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表再設(shè)置幾次重復(fù)，進(jìn)行進(jìn)一步的試驗(yàn)，通過(guò)有重復(fù)試驗(yàn)的方差分析，提高分析的靈敏度，試驗(yàn)確定其他因素對(duì)修飾酶活性的重要影響程度[20]。

本病主要發(fā)生于雙月齡前后15日齡左右的仔豬，尤以生長(zhǎng)快、肥胖的仔豬較易發(fā)生。小至數(shù)日齡、大至4月齡也偶有發(fā)生。一年四季均可發(fā)生，但以3～5月和9～11月多發(fā)，常呈散發(fā)性流行，多在氣候驟變和陰雨季節(jié)發(fā)病，傳染源主要是帶菌母豬和仔豬，常發(fā)病突然，死亡率高。

2.3 生姜蛋白酶修飾酶與天然酶學(xué)性質(zhì)比較

2.3.1 最適溫度

圖 5 生姜蛋白酶修飾酶與天然酶最適反應(yīng)溫度的比較Fig.5 Comparison of optimum temperature between modifi ed and natural zingibain

由圖5可知，以酪蛋白為底物時(shí)，天然生姜蛋白酶的最適溫度為55℃，經(jīng)過(guò)活化右旋糖苷修飾后的修飾酶的最適溫度為50℃。這可能是因?yàn)榛瘜W(xué)修飾通過(guò)改變酶的構(gòu)象而降低了酶催化反應(yīng)所需要的化學(xué)能，因此表現(xiàn)為酶的最適溫度有所下降[16,18]。

2.3.2 最適反應(yīng)pH值

圖 6 生姜蛋白酶修飾酶與天然酶最適反應(yīng)pH值的比較 Fig.6 Comparison of optimum pH between modifi ed and natural zingibain

由圖6可知，以酪蛋白為底物時(shí)，天然生姜蛋白酶的最適pH值為6.0，經(jīng)過(guò)活化右旋糖苷修飾后的修飾酶的最適pH值為5.0～5.5。這可能是由于右旋糖苷修飾了酶表面的堿性氨基酸殘基的側(cè)鏈氨基[16,18]，右旋糖苷的引入影響了酶分子的電荷分布，從而影響酶的最適pH值。

2.3.3 熱穩(wěn)定性比較

將修飾前后的生姜蛋白酶和底物溶液在80℃保溫一定時(shí)間，然后測(cè)定不同熱處理時(shí)間的殘留酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖7。隨著熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)，天然生姜蛋白酶和修飾酶的酶活力均呈下降趨勢(shì)，但修飾酶的活力下降幅度較小，保溫60min后天然生姜蛋白酶與修飾酶的殘留酶活力分別為35.1%和61.8%；保溫80min后天然生姜蛋白酶與修飾酶的殘留酶活力分別為19.1%和47.2%。說(shuō)明修飾酶的熱穩(wěn)定性比天然生姜蛋白酶明顯提高，這可能是因?yàn)槊概c修飾劑交聯(lián)后，使酶的天然構(gòu)象產(chǎn)生“剛性”，不易伸展打開(kāi)，減少了酶分子內(nèi)部基團(tuán)的熱振動(dòng)，從而增強(qiáng)了酶的熱穩(wěn)定性[19]。

圖 7 60℃條件下生姜蛋白酶修飾酶與天然酶熱穩(wěn)定性的比較 Fig.7 Comparison of heat stability at 60 ℃ between modifi ed and natural zingibain

2.3.4 生姜蛋白酶修飾酶和天然酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較

圖 8 生姜蛋白酶修飾酶與天然酶對(duì)底物的Km比較Fig.8 Comparison of Km between modifi ed and natural zingibain

由圖8可知，生姜蛋白酶天然酶和修飾酶的Km值分別為0.21μg/mL和0.14μg/mL，天然酶的Km值是修飾酶1.5倍，天然酶和修飾酶的最大反應(yīng)速率分別為17.54μg/(min·mL)和35.84μg/(min·mL)。這可能是因?yàn)榛罨倚擒諏?duì)生姜蛋白酶的空間結(jié)構(gòu)或其反應(yīng)環(huán)境有所改變，從而增加了底物與生姜蛋白酶的親和力，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

2.3.5 紫外吸收光譜分析

由圖9可知，在pH6.0、0.05mol/L 磷酸緩沖液中，天然生姜蛋白酶的紫外吸收光譜有2個(gè)明顯的吸收峰，吸收波長(zhǎng)分別為219nm和273nm。與天然生姜蛋白酶相比，修飾酶在200～250nm處吸收波長(zhǎng)向長(zhǎng)波長(zhǎng)方向偏移6nm，其機(jī)理可能是右旋糖苷的引入改變了酶分子的微環(huán)境，使分子內(nèi)部的結(jié)構(gòu)趨于松散，n和π*軌道間的能量差減小，引起吸收峰向長(zhǎng)波長(zhǎng)方向偏移[21]。修飾酶在270～280nm波長(zhǎng)處沒(méi)有明顯吸收峰，進(jìn)一步說(shuō)明修飾酶的構(gòu)型構(gòu)象發(fā)生了變化。

圖 9 生姜蛋白酶修飾酶與天然酶的紫外吸收光譜Fig.9 Ultraviolet absorption spectra of modifi ed and natural zingibain

3 結(jié)論與討論

相關(guān)研究報(bào)道表明[14,16,18,22]，修飾時(shí)間越長(zhǎng)，反應(yīng)越徹底，但修飾時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能導(dǎo)致本來(lái)不太穩(wěn)定的中間產(chǎn)物分解，同樣不利于修飾反應(yīng)的進(jìn)行；修飾劑用量會(huì)影響酶蛋白氨基修飾率和修飾酶的性質(zhì)，修飾劑用量增大，修飾程度加大，酶表面偶聯(lián)的大分子修飾劑形成空間位阻效應(yīng)，使底物不易與酶活性位點(diǎn)接近和相互作用而致使酶活性下降，氨基修飾率過(guò)高，修飾酶活性反而降低；一般情況下，提高pH值可以提高修飾反應(yīng)速率，但右旋糖苷分子上的醛基(與酶蛋白側(cè)鏈氨基共價(jià)結(jié)合得到修飾酶)在堿性條件下不穩(wěn)定，會(huì)發(fā)生羥醛縮合反應(yīng)，致使修飾率下降，進(jìn)而影響修飾酶活性；修飾反應(yīng)溫度越高，反應(yīng)速率越大，但酶分子結(jié)構(gòu)由于各基團(tuán)在高溫下的熱運(yùn)動(dòng)而趨于松散，容易出現(xiàn)修飾過(guò)度、酶蛋白變性等情況，最終導(dǎo)致修飾酶活性降低。

本實(shí)驗(yàn)采用NaIO4活化的右旋糖苷對(duì)生姜蛋白酶進(jìn)行化學(xué)修飾，結(jié)果顯示，修飾反應(yīng)溫度、pH值、酶與活化右旋糖苷的質(zhì)量比和修飾時(shí)間對(duì)酶蛋白氨基修飾率和修飾酶的活性都有較大影響，且修飾率在一定范圍內(nèi)與修飾酶活力呈正比關(guān)系，但修飾率最高時(shí)修飾酶活力反而降低，試驗(yàn)確定的較佳修飾反應(yīng)條件為溫度42℃、pH6.0、酶與活化右旋糖苷質(zhì)量比1：22、修飾時(shí)間3h。與天然生姜蛋白酶相比較，修飾酶的相對(duì)酶活力提高了2.0倍，酶蛋白氨基修飾率為57.8%。以酪蛋白為底物時(shí)，修飾酶的最適溫度、最適pH值和Km值(酶促反應(yīng)速率達(dá)到最大反應(yīng)速率50%所對(duì)應(yīng)的底物濃度)較天然生姜蛋白酶均有所降低，表明通過(guò)活化右旋糖苷修飾酶蛋白分子能夠降低酶催化反應(yīng)所需要的化學(xué)能，提高生姜蛋白酶對(duì)底物的親和力，從而提高修飾酶的活性。修飾酶的熱穩(wěn)定性比天然生姜蛋白酶明顯增強(qiáng)，80℃熱處理80min后生姜蛋白酶天然酶與修飾酶的殘留酶活力分別為19.1%和47.2%；紫外吸收光譜測(cè)定顯示，修飾酶在200～250nm波長(zhǎng)處吸收波長(zhǎng)向長(zhǎng)波長(zhǎng)方向偏移6nm，可能是酶與修飾劑交聯(lián)后構(gòu)型構(gòu)象發(fā)生改變，增強(qiáng)了熱穩(wěn)定性，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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