高靈敏度測定殼聚糖酶活力的新方法及其比較研究

張永勤，張 杰，常海燕，張 坤，劉征東，羅彩華，牟曉鳳

(青島科技大學化工學院，山東 青島 266042)

近年來，隨著低聚殼聚糖以及殼寡糖在醫藥、生物材料、生物能源、食品工業、化妝品以及環境保護等諸多領域的不斷應用，殼聚糖水解酶已成為國內外諸多學者的研究熱點[1-5]。在殼聚糖的水解工藝中，與傳統化學水解法相比，酶解法更易控制，底物特異性強，副產物少。但是，由于殼聚糖酶的活力測定方法普遍具有較低的靈敏度，一方面影響了殼聚糖酶產生菌的篩選進程，致使殼聚糖酶的價格居高不下[6]，另一方面也限制了殼聚糖酶在應用過程中的質量控制。酶活力是衡量水解酶性能的關鍵指標，酶活力測定方法的研究，能夠為殼聚糖水解酶在篩選、生產和應用過程中提供有效的質量控制手段。因此，尋求一種有效的殼聚糖水解酶活力測定方法對于殼聚糖產業發展十分重要。目前常用Somogyi-Nelson法[7]、3,5-二硝基水楊酸法(DNS法)[8]、鐵氰化鉀法[9]和BCA法[10-11]測定多糖水解酶活力，但由于這些方法或多或少存在靈敏度、測定范圍、試劑高毒性、蛋白質影響等問題導致了其在多糖水解酶活力測定的應用上受到不同程度的限制[12]。

本實驗將3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽水合物(MBTH)高靈敏度測定還原糖含量的方法[13-14]應用到殼聚糖酶的活力測定中，以高脫乙酰殼聚糖為酶解底物，并針對殼聚糖本身的物化特性設計并優化活力測定方法。近年來有學者報道了果膠酶[15]、木瓜蛋白酶[16]、蛋白酶[17]、溶菌酶[18]以及纖維素酶[6,19-20]等都具有殼聚糖水解酶活力，特別是纖維素酶具有的殼聚糖水解酶活力較高[21]。考慮到殼聚糖酶的純酶制劑價格昂貴，因此，本研究以含有殼聚糖酶活力的纖維素酶制劑為實驗材料，利用MBTH法測定其所含有的微量殼聚糖水解酶活力，并與目前最常采用的DNS法和鐵氰化鉀法做對比，以期對殼聚糖酶的定量、篩選與應用提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

纖維素酶(ROCKSOFTTM ACE P150) 日本Dyadic公司；殼聚糖(93.5%脫乙酰度，1H NMR) 實驗室自制；氨基葡萄糖、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽水合物(MBTH)、二硫蘇糖醇(DTT) 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

SHZ-82恒溫水浴振蕩器 常州智博瑞儀器制造有限公司；UNICO-2100紫外-可見分光光度計 尤尼科(上海)儀器有限公司；pH計 梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司；移液器 賽默飛世爾(上海)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 殼聚糖溶液的配制

稱取2.000g殼聚糖于500mL燒杯內，逐滴加入10mL 0.2mol/L醋酸溶液，攪拌至殼聚糖完全溶解，且體系呈透明凝膠狀，在4℃冰箱靜置2h。加入適量0.2mol/L醋酸鈉溶液，攪拌至膠狀體系溶解，調節pH值至6.0，適當時可加微量10mol/L氫氧化鈉溶液調節溶液pH值。將溶液轉移至500mL容量瓶內，用0.2mol/L、pH6.0醋酸-醋酸鈉緩沖溶液定容至500mL，充分混勻。配制成4mg/mL的殼聚糖溶液于4℃冰箱內貯藏備用。整個酶解體系使用0.2mol/mL、pH6.0醋酸-醋酸鈉緩沖溶液為溶劑，以下同。

1.2.2 氨基葡萄糖標準曲線的繪制

MBTH法：用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液分別配制終質量濃度為0～80μg/mL的氨基葡萄糖溶液(每個稀釋度各含有2mg/mL殼聚糖底物)，取2mL該溶液與2mL 0.5mol/L氫氧化鈉溶液充分混勻，8000r/min離心5min，取1mL上清液與0.5mL MBTH試劑充分混勻，于80℃水浴15min，迅速加入1mL硫酸鐵銨試劑(0.5g/100mL (FeNH4(SO4)2)·12H2O、0.5%氨基磺酸、0.5mol/L鹽酸)，混勻，于655nm波長處測定吸光度，每組3個平行樣。

DNS法：參照Miller[8]的方法，并根據本實驗殼聚糖酶活力測定方法的特點稍加修改。用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液配制終質量濃度為0～1.5mg/mL的氨基葡萄糖溶液(每個稀釋度各含有2mg/mL殼聚糖底物)。取2mL還原糖溶液與0.2mL 10mol/L氫氧化鈉溶液充分混勻，8000r/min離心5min，取0.4mL上清液向其中加入0.3mL DNS試劑，沸水浴15min，迅速冷卻，加入4.3mL蒸餾水中，充分混勻，于500nm波長處測定吸光度值，每組3個平行樣。

鐵氰化鉀法：參照文獻[9]的方法，并根據本實驗殼聚糖酶活力測定方法的特點稍加修改。用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液配制終質量濃度為0～100μg/mL的氨基葡萄糖溶液(每個稀釋度各含有2mg/mL的殼聚糖底物)。取4mL還原糖溶液加入0.4mL 10mol/L氫氧化鈉溶液，充分混勻，8000r/min離心5min，取1.2mL上清液與1.6mL鐵氰化鉀試劑充分混勻，沸水浴15min，迅速冷卻，于420nm波長處測定吸光度，每組3個平行樣。

1.2.3 酶活力測定方法

多點法(罐法、動力學法、動態法)：在錐形瓶中將已預熱的底物溶液與酶溶液迅速充分混勻(MBTH：19.8mL底物＋0.2mL酶溶液，DNS：10mL底物＋10mL酶溶液，鐵氰化鉀：36.4mL底物＋0.4mL酶溶液；底物終質量濃度均為2mg/mL)，在37℃條件下水浴加熱，分別在0、10、20、30、40、50、60min時取酶解液與氫氧化鈉充分混合終止反應(MBTH：2mL酶解液＋2mL 0.5mol/L氫氧化鈉，DNS：2mL酶解液＋0.2mL 10mol/L氫氧化鈉，鐵氰化鉀法：4mL酶解液＋0.4mL 10mol/L氫氧化鈉)，8000r/min離心15min，取上清液，按照1.2.2節中的方法測定酶解液中還原糖含量，每組做3個平行樣。

終點法(試管法)：在試管中將已預熱的1mL 4mg/mL底物溶液與1mL酶溶液充分混勻(底物終質量濃度為2mg/mL)，在37℃條件下水浴加熱反應1h，加入氫氧化鈉終止反應(各方法中氫氧化鈉濃度與比例同上)，8000r/min離心15min，取上清，按照1.2.2節中的方法測定酶解液中還原糖含量，每組做3個平行樣。

酶活力單位(1U)定義：在上述MBTH法的反應條件下，使每毫升酶解液每分鐘產生相當于1μmol氨基葡萄糖的還原糖的量所需的酶量為一個酶活力單位。檢測限(DL)和定量限(QL)根據公式(1)和(2)[22]計算所得。

式中：Sbi是9個空白溶液的標準偏差；b為回歸方程的斜率。

1.2.4 酶動力學曲線的測定方法

將纖維素酶溶液與殼聚糖底物溶液按一定比例混合，在37℃條件下水浴加熱，分別在0、10、20、30、40、50、60min時終止反應，酶解液在8000r/min條件下離心15min，按照1.2.2節的方法測定還原糖含量，每個樣品組做3個平行樣。

1.2.5 底物質量濃度對酶活力測定的影響

分別配制質量濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.40、0.50、0.80mg/mL的殼聚糖底物溶液，取0.2mL酶溶液與19.8mL底物溶液在試管(100mm×15mm)中混合，在37℃條件下水浴加熱，分別于0、10、20、30、40、50、60min時終止反應。取酶解液在8000r/min條件下離心15min，按照1.2.2節的方法測定還原糖含量，每個樣品組做3個平行樣。

1.2.6 酶質量濃度曲線的繪制

按照1.2.3節的多點測定法進行酶活力測定，其中纖維素酶溶液用0.2mol/L、pH6.0醋酸-醋酸鈉溶液配制， 并相應稀釋8個質量濃度梯度，使酶解液中纖維素酶濃度分別為0～150μg/mL(MBTH法)、0～1.2mg/mL(DNS法)、 0～100μg/mL(鐵氰化鉀法)。檢測限和定量限參照1.2.3節計算。

2 結果與分析

2.1 MBTH法測定氨基葡萄糖的標準曲線及其比較

圖 1 3種方法測定氨基葡萄糖標準曲線(MBTH、鐵氰化鉀、DNS)Fig.1 Standard curves of glucosamine for the three method, MBTH, Schales’ Procedure and DNS methods

由圖1可知，在測定氨基葡萄糖濃度時，MBTH法靈敏度最高，其檢測限為4.5μmol/mL，而DNS法和鐵氰化鉀法分別為320μmol/mL和8.0μmol/mL。在DNS法中，氨基葡萄糖濃度較低時，無法檢測出溶液中的還原糖含量，從而導致其標準曲線很難過原點[7-8]，而在3.8mmol/mL以上的濃度點回歸而成的標準曲線更接近原點，如圖1中的嵌入圖所示。鐵氰化鉀法屬減色法，空白的吸光度決定著該方法的檢測范圍，其空白值的測定誤差也決定著還原糖的檢測限。當還原糖濃度超過340μmol/mL時，隨著還原糖濃度的增高吸光度呈非線性變化，超出了該法的檢測范圍，即樣品吸光度趨向零，無法測出還原糖含量，從而導致該法工作濃度范圍過于狹窄。相比之下，MBTH法避開了上述缺點，其靈敏度是鐵氰化鉀法的1.8倍，DNS法的71倍，具有較寬的檢測范圍，特別適合于微量還原糖濃度的測定。

2.2 酶活力測定方法的建立及底物質量濃度對酶活力測定的影響

考慮到本實驗所使用的纖維素酶在pH6.0(最適pH值)和55℃(最適溫度)條件下預熱15min，其酶活力即損失50%[23]；殼聚糖在較高溫度條件下會發生非酶降解；過低的酶解溫度難以在一般實驗室溫度條件下得以控制，因此，本實驗將酶解溫度設定在37℃。由于殼聚糖不溶于堿性環境，當加入NaOH終止反應時會產生大量沉淀，需在離心后取上清液進行還原端基濃度的測定。在理論上，酶解反應中底物質量濃度越高，酶解反應速率越能維持在最大值。但是，由于過高的底物濃度具有較高黏度而影響酶解進程(傳質速率較慢)；在酶解終止后會產生大量沉淀而減少上清液體積；會使底物本身的還原基團濃度增加而導致本底值(即空白值)增加；且會增加測定成本等，因此，選擇合適的底物濃度有助于該酶活力的準確測定。

圖 2 不同底物質量濃度條件下MBTH法動力學曲線Fig.2 Kinetic curves of various substrate concentrations for MBTH method

圖2為在不同殼聚糖底物質量濃度條件下的酶解進程曲線。在該圖中，當底物質量濃度在0.05、0.10mg/mL時，酶解反應速率分別在20、30min內保持恒定，隨后酶解反應速率逐漸降低，即產物生成量與酶解時間呈非線性關系，這可能是因為隨著酶解反應的進行，底物殼聚糖被不斷消耗而釋放出還原端基，使酶不再與底物達到飽和，或者是反應體系中不斷增加的還原端基造成的產物抑制作用而導致了反應速率的下降。

當底物質量濃度高于0.20mg/mL及以上時，酶解反應速率與酶解時間在整個酶解過程中始終保持線性增加關系。另外，在0.05mg/mL時，酶解反應20min內的產物生成量只有46μmol/mL，而動力學參數如Km值的測定往往需要測定底物質量濃度在Km值附近的酶解反應速率。因此，MBTH法的高靈敏度足夠用來測定動力學參數。然而，由于DNS法的靈敏度較低，其氨基葡萄糖的檢測限為320μmol/mL，很難檢測到產物還原端基濃度在200μmol/mL以下的酶解速率變化(圖2)，而增加酶濃度確實可以提高酶解速率從而增加產物濃度，但又會使酶解反應背離零級反應而很難測得酶解初速率，此外，在高底物濃度條件下，酶解速率變化不明顯(圖3)，會引入較大測量誤差，因此，用DNS法較難準確測定Km值。在圖3的整個酶解過程中，隨著底物質量濃度的增加，酶解反應速率逐漸遞增。在低底物質量濃度范圍內，反應速率與底物濃度呈線性增加關系。在底物質量濃度增加到0.30mg/mL之后，反應速率增加緩慢并最終趨于平緩。根據圖3雙倒數曲線公式為y=0.0303x+0.2494(R2=0.9957)計算可得Km為0.12mg/mL，遵循底物質量濃度可盡量大，但又不影響測定的原則，因此，本實驗選擇2mg/mL(16.7倍的Km值)作為酶活力測定的底物終質量濃度。

圖 3 底物質量濃度與反應速率的關系和雙倒數曲線圖(MBTH法)Fig.3 Relationship between substrate concentration and reaction rate and Double reciprocal Lineweaver-Burk plots in MBTH method

2.3 MBTH法動態測定殼聚糖酶活力及其比較

圖 4 不同酶質量濃度條件下MBTH法動力學曲線Fig.4 Kinetic curves of various enzyme concentrations for MBTH method

由圖4可知，不同的酶質量濃度條件下，酶解反應速率(即單位時間內產物生成量)隨時間呈線性增加關系。這一線性關系說明，在不同的酶質量濃度條件下，酶解反應均達到最大反應速率，并且在60min內保持恒定。另外，只有當底物用量足以在60min內使底物與酶的結合始終保持飽和狀態，才能保證酶解反應速率恒定在最大值。因此，可以說明實驗中所使用的底物質量濃度要遠大于酶對底物的Km值。在這樣的底物質量濃度條件下，反應速率會隨著酶質量濃度增加成比例增加。在測定酶活力時，只有保證在測定過程中，酶解反應速率始終保持在一個恒定的最大值，才能確保酶活力測定的準確性。因此，在測定酶活力時，選擇在酶解反應60min以內測定酶活力是比較準確的，因此，按照1.2.3節中的試管法即可以代替操作繁瑣的動力學法用于常規酶活力測定。

圖 5 不同酶質量濃度條件下鐵氰化鉀法動力學曲線Fig.5 Kinetic curves of various enzyme concentrations for potassium ferricyanide method

圖 6 MBTH法、鐵氰化鉀法和DNS法測定酶質量濃度曲線Fig.6 Enzyme concentration curves for MBTH, DNS and potassium ferricyanide method

鐵氰化鉀法測殼聚糖酶活力的動力學曲線如圖5所示，其結果接近MBTH法，除在2.1節中所討論的由于該法屬減色法使檢測范圍較窄之外，較大的空白值也會使該酶活力的檢測限偏高，而且，由于該法取樣量較大，不利于在線監測。另外，由于殼聚糖本身對鐵氰化鉀有一定吸附作用，因此，終止反應后需馬上離心取上清液。盡管鐵氰化鉀法有諸多缺陷，但是，由圖6可知，其酶活力測定結果與MBTH法相近，以MBTH法的酶活力定義為基準，其檢測限為20mU/mL，是MBTH法(13mU/mL)的1.6倍。

圖 7 不同酶質量濃度條件下DNS法動力學曲線Fig.7 Kinetic curves of various enzyme concentrations for DNS method

而對于DNS法而言，以MBTH法的酶活力定義為基準，其檢測限為1.5U/mL，是MBTH法的116倍。如圖6和圖7所示，當酶活力單位在1.5～21.6U/mL以內時，酶解反應速率與酶質量濃度呈線性增加關系；當酶解速率超過21.6U/mL時，盡管在不同酶質量濃度條件下的酶動力學曲線仍各呈線性遞增，但是，隨著酶質量濃度的增加，酶解反應速率逐漸處于非線性遞增，最終曲線趨于平緩。這主要是因為酶濃度過高，底物消耗過多，酶解產物導致產物抑制。另外，之所以動力學曲線仍呈線性遞增，是由于DNS法所測還原端基的摩爾吸光系數與酶解產物的聚合度密切相關，而且，聚合度越低摩爾吸光系數越大[24-26]，從而造成線性動力學曲線的假象，致使酶質量濃度線性部分斜率(y=0.0641x－2.6419)超出鐵氰化鉀法法(y=0.0337x+0.0631)和MBTH法(y=0.0321x+0.0407)1倍之多，因此，DNS法測定殼聚糖酶活力是不準確的，它不適于生產中的質量控制、銷售等環節中的準確定量。

3 結 論

建立了一種新的高靈敏度測定殼聚糖酶活力的方法——MBTH法，利用動力學法研究了該活力測定方法的測定參數，在37℃、pH6.0反應條件下殼聚糖底物溶液的終質量濃度需在2mg/mL以上，酶解時間在60min以內。MBTH法準確、靈敏、檢測范圍寬、操作簡便，可以用終點法定量測得殼聚糖酶活力，且可用于DNS法較難測得的較小Km值的測定。該法測定結果近似于鐵氰化鉀法，DNS法廣泛用于殼聚糖酶的篩選、分離純化、應用中的工藝優化，但不適于質量控制、銷售等環節中的準確定量。

[1] TOKORO A, TATEWAKI N, SUZUKI K, et al. Growth-Inhibitory effect of hexa-N-acetylchitohexanse and chitohexaose against meth： a solid tumor[J]. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 1988, 36(2)： 784-790.

[2] SHAHIDI F, ARACHCHI J K V, JEON Y J. Food applications of chitin and chitosans[J]. Trends in Food Science & Technology, 1999, 10(2)： 37-51.

[3] INOKUMA K, TAKANO M, HOSHINO K. Direct ethanol production from N-acetylglucosamine and chitin substrates by mucor species[J]. Biochemical Engineering Journal, 2013, 72： 24-32.

[4] KUMAR M N V R. A review of chitin and chitosan applications[J]. Reactive and Functional Polymers, 2000, 46(1)： 1-27.

[5] TSAI Guojane, WU Zenyuon, SU Wenhuey. Antibacterial activity of a chitooligosaccharide mixture prepared by cellulase digestion of shrimp chitosan and its application to milk preservation[J]. Journal of Food Protection, 2000, 63(6)： 747-752.

[6] LIU Jing, XIA Wenshui. Purification and characterization of a bifunctional enzyme with chitosanase and cellulase activity from commercial cellulose[J]. Biochemical Engineering Journal, 2006, 30(1)： 82-87.

[7] SOMOGYI M. A new reagent for the determination of sugars[J]. Journal of Biological Chemistry, 1945, 160： 61-68.

[8] MILLER G. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar[J]. Analytical Chemistry, 1959, 31(3)： 426-436.

[9] IMOTO T, YAGISHITA K. A simple activity measurement of lysozyme[J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1971, 35(7)： 1154-1156.

[10] WAFFENSCHMIDT S, JAENICKE L. Assay of reducing sugars in the nanomole range with 2,2’-bicinchoninate[J]. Analytical Biochemistry, 1987, 165(2)： 337-340.

[11] GARCIA E, JOHNSTON D, WHITAKER J R, et al. Assessment of endo-1,4-β-D-glucanase activity by a rapid colorimetric assay using disodium 2,2’-bicinchoninate[J]. Journal of Food Biochemistry, 1993, 17(3)： 135-145.

[12] 張永勤, 薛長湖, 湯浩源, 等. 還原糖的可見分光光度法研究進展[J]. 食品與發酵工業, 2007, 33(5)： 97-104.

[13] ANTHON G E, BARRETT D M. Determination of reducing sugars with 3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone[J]. Analytical Biochemistry, 2002, 305(2)： 287-289.

[14] HORN S J, EIJSINK V G. A reliable reducing end assay for chitooligosaccharides[J]. Carbohydrate Polymers, 2004, 56(1)： 35-39.

[15] KITTUR F S, KUMAR A B V, THARANATHAN R N. Low molecular weight chitosans： preparation by depolymerization with Aspergillus niger pectinase, and characterization[J]. Carbohydrate Research, 2003, 338(12)： 1283-1290.

[16] RONCAL T, OVIEDO A, ARMENTIA I L D, et al. High yield production of monomer-free chitosan oligosaccharides by pepsin catalyzed hydrolysis of a high deacetylation degree chitosan[J]. Carbohydrate Research, 2007, 342(18)： 2750-2756.

[17] LI Jin, DU Yumin, LIANG Hongbo. Infl uence of molecular parameters on the degradation of chitosan by a commercial enzyme[J]. Polymer Degradation and Stability, 2007, 92(3)： 515-524.

[18] ZHANG Yongqin, WANG Zheping, ZHANG Jie, et al. Quantitative determination of chitinolytic activity of lysozyme using halfdeacetylated chitosan as a substrate[J]. Carbohydrate Polymers, 2011, 85(3)： 554-559.

[19] PANTALEONE D, YALPANI M, SCOLLAR M. Unusual susceptibility of chitosan to enzymic hydrolysis[J]. Carbohydrate Research, 1992, 237(1)： 325-332.

[20] ZHANG Yongqin, ZHANG Xiaoyang, DING Ruoran, et al. Determination of the degree of deacetylation of chitosan by potentiometric titration preceded by enzymatic pretreatment[J]. Carbohydrate Polymers, 2011, 83(2)： 813-817.

[21] XIA Wenshui, LIU Ping, LIU Jing. Advance in chitosan hydrolysis by non-specifi c cellulases[J]. Bioresource Technology, 2008, 99(15)： 6751-6762.

[22] MILLER J N. Basic statistical methods for analytical chemistry Part 2. Calibration and regression rethods a review[J]. Analyst, 1991, 116： 3-14.

[23] 張永勤. 強制滲透法制備水溶性殼聚糖及其固定化酶解方法與產物研究[D]. 青島： 中國海洋大學, 2005.

[24] BREUIL C, SADDLER J N. Comparison of the 3,5-dinitrosalicylic acid and nelson-somogyi methods of assaying for reducing sugars and determining cellulase activity[J]. Enzyme and Microbial Technology, 1985, 7： 327-332.

[25] SENGUPTA S, JANA M L, SENGUPTA D. A note on the estimation of microbial glycosidase activities by dinitrosalicylic acid reagent[J]. Applied Microbiol Biotechnology, 2000, 53： 732-735.

[26] SAQIB A A N, WHITNEY P J. Differential behaviour of the dinitrosalicylic acid (DNS) reagent towards mono- and di-saccharide sugars[J]. Biomass and Bioenergy, 2011, 35： 4748-4750.