熱處理對牛乳鐵蛋白促成骨細胞增殖活性影響

劉 猛，杜 明*，孔瑩瑩，徐偉麗，宋 微，張蘭威

(哈爾濱工業大學食品科學與工程學院，黑龍江 哈爾濱 150090)

乳鐵蛋白(Lf)又稱乳鐵傳遞蛋白，主要存在于哺乳動物的各種外分泌物中，如乳汁、淚液或唾液等[1]。Lf可以作為一種鐵強化劑調控鐵的生物利用率，此外，Lf還具有多種其他生物功能，例如抗菌、抗病毒和抗氧化作用，參與機體免疫調節，增強機體抗病能力[2]等。近期，乳鐵蛋白被發現具有促骨生長的功效[3-4]。諸多研究表明，Lf既能刺激成骨細胞(osteoblast，OB)增殖，促進成骨細胞增殖與分化、也能抑制破骨細胞生長與活性、誘導破骨細胞(osteoclast，OC)凋亡[5-6]。體內研究表明，乳鐵蛋白在骨生長和代謝中起到一定的生理作用，能促進骨骼生長[7]。在乳品加工業中，熱處理是最為常見的操作單元，然而迄今為止，熱處理對乳鐵蛋白活性的影響研究主要集中在抗菌活性等方面。熱處理對乳鐵蛋白成骨作用的影響報道很少，本實驗主要研究熱處理(溫度和時間)對乳鐵蛋白成骨活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

SD大鼠乳鼠(72h以內)由哈爾濱醫科大學第二附屬醫院提供。

乳鐵蛋白(＞94%)、Ⅱ型膠原酶、MTT 美國Sigma公司；α-MEM培養基、胎牛血清 美國Hyclone公司；胰蛋白酶-EDTA消化液 Solarbio公司；二甲基亞砜(DMSO)、巴比妥鈉 美國Gibco公司。

倒置式生物顯微鏡 日本Nikon公司；Eon型酶標儀 美國BioTek公司；HEPA class 100型細胞培養箱 美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 成骨細胞分離鑒定

從新生SD大鼠乳鼠中提取成骨細胞，通過形態觀察、HE 染色、堿性磷酸酶染色及礦化結節染色來鑒定成骨細胞[8]。

1.2.2 實驗分組及熱處理

樣品分組：Lf低質量濃度組(50μg/mL)、中質量濃度組(100μg/mL)、高質量濃度組(500μg/mL)。熱處理條件：62～65℃處理 30min、72℃處理 10s、85℃處理10min以及95℃處理10min。以未經加熱的乳鐵蛋白(Native-Lf)為對照。

1.2.3 MTT法測定成骨細胞增殖

調節細胞質量濃度為每孔l×105個/mL接種于96孔培養板中，每孔加入100μL細胞懸液。細胞貼壁后，棄培養液，每孔再加入95μL培養液以及5μL樣品溶液。測定前4h，加10μL 0.5mg/mL MTT(pH7.2 0.01mol/L PBS配制)，培養箱中孵育4h。棄去培養液，每孔加150μL DMSO，振蕩10min使結晶溶解。波長490nm 處測定OD490nm[9]。

1.2.4 統計學分析及繪圖

數據采用 Origin8.0軟件進行計算繪圖。采用SPSS 17.0統計軟件，One-way ANOVA進行顯著性檢驗。數據以±s表示，P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 成骨細胞的鑒定

圖 1 SD大鼠乳鼠成骨細胞分離與鑒定Fig.1 Isolation and identifi cation of osteoblasts from newborn SD rats

倒置顯微鏡觀察成骨細胞，以不規則形、長梭形、三角形為主，相鄰細胞彼此貼靠，邊界難以分清，結果如圖1a所示，HE染色、堿性磷酸酶染色、礦化結節染色分別如圖1b～d所示，這些染色結果均表明分離的細胞具有成骨細胞的所有特征[8]。

2.2 Native-Lf對成骨細胞增殖的影響

圖 2 未經過熱處理的Lf對成骨細胞增殖的促進作用Fig.2 Osteoblast-promoting activity of lactoferrin without heat treatment

Native-Lf對成骨細胞增殖作用影響如圖2所示，Native-Lf低質量濃度組(50μg/mL)在24、48、72h對成骨細胞增殖具有顯著的促進作用；中質量濃度組(100μg/mL)作用細胞24h能顯著性促進成骨細胞增殖，48h和72h能極顯著促進細胞增殖；高質量濃度組(500μg/mL)在24h和48h能極顯著促進細胞增殖，在72h時顯著促進成骨細胞增殖。在一定質量濃度范圍內，Native-Lf對成骨細胞增殖作用呈劑量依賴關系，這與文獻[5,10]報道具有一致性。但24～72h不同時間點表現出的趨勢略有不同，24h條件下，高質量濃度 Native-Lf活性最高，與中質量濃度和低質量濃度組差異顯著；48h中質量濃度和高質量濃度組Native-Lf活性顯著高于低質量濃度組；72h條件下，中質量濃度的活性顯著高于低質量濃度組和高質量濃度組。整體上看，隨著作用時間的延長，Native-Lf的最佳作用質量濃度有一定的下降趨勢。

2.3 不同溫度熱處理對乳鐵蛋白成骨細胞增殖的影響

2.3.1 65℃加熱處理Lf對成骨細胞增殖作用影響

Lf經過65℃加熱處理30min，對成骨細胞作用結果如圖3所示。24h，質量濃度在50～500μg/mL時能顯著促進成骨細胞增殖；48h和72h，低質量濃度組可顯著促進成骨細胞增殖，在Lf為100μg/mL時能極顯著促進成骨細胞增殖。高質量濃度組在48h和72h相對于對照組，有少量增加，但差異不顯著。這些結果說明65℃/30min對Lf的活性影響在50～100μg/mL范圍內幾乎無顯著影響，對于高質量濃度組有一定的影響。研究表明，這4種加熱參數對于乳鐵蛋白熱聚集的誘導作用是不同的，隨著加熱強度的提高，乳鐵蛋白的熱聚集作用增強。高質量濃度時，Lf熱聚集的趨勢相應增強，相應地Lf的生理活性受影響也較為明顯。

圖 3 65℃/30min處理的Lf對成骨細胞增殖的影響Fig.3 Effect of 65 ℃/30 min on the osteoblast-promoting activity of lactoferrin

2.3.2 72℃加熱處理Lf對成骨細胞增殖作用影響

圖 4 72 ℃/10s處理LF對成骨細胞增殖的影響Fig.4 Effect of 72 ℃/10 s on the osteoblast-promoting activity of lactoferrin

Lf經72℃加熱處理10s，對成骨細胞增殖作用結果如圖4所示。在各個時間點條件下，各質量濃度組均可顯著促進成骨細胞增殖，而且低質量濃度組(50μg/mL)顯著高于中質量濃度組(100μg/mL)和高質量濃度組(500μg/mL)。整體趨勢與未經加熱處理的Lf相差不大，這說明72℃/10s對Lf的活性影響相對較小，尤其對于質量濃度較低的情況影響較小。

2.3.3 85℃加熱處理Lf對成骨細胞增殖作用影響

Lf經85℃加熱處理10min，對成骨細胞增殖作用如圖 5所示。24h時，低質量濃度組可極顯著促進細胞增殖，中質量濃度組與對照組差異顯著，高質量濃度組則極顯著抑制細胞增殖；48h時，Lf在中低質量濃度時與對照組差異不顯著，在高質量濃度時則極顯著抑制成骨細胞增殖；72h，低質量濃度組可極顯著促進細胞增殖，中質量濃度組時與對照組相比無顯著差異，高質量濃度組則顯著性抑制成骨細胞增殖。這些結果表明，85℃/10min對Lf活性影響較大，整體上呈下降趨勢，在高質量濃度組影響較大。而且在不同時間點，活性表現不同，分析可能是由于Lf對調控成骨細胞增殖的信號通路調控作用不同造成的[11-12]。

成骨細胞的生長分化主要由以絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)細胞信號轉導通路介導。主要包括ERK、JNK 和p38MAPK 3個亞通路。有研究報導了Lf調控成骨細胞p42/44MAPK等信號轉導通路促進成骨細胞分化增殖，并明顯地抑制成骨細胞凋亡[12]。因此，有本研究結果推測，Lf對這些信號通路的調控可能發生在不同的階段，由此造成了上述現象。

圖 5 85℃/10min處理Lf對成骨細胞增殖的影響Fig.5 Effect of 85 ℃/10 min on the osteoblast-promoting activity of lactoferrin

2.3.4 95℃加熱處理Lf對成骨細胞增殖作用影響

圖 6 95℃/10min處理Lf對成骨細胞增殖的影響Fig.6 Effect of 95 ℃/10 min on the osteoblast-promoting activity of lactoferrin

Lf經95℃加熱處理10min，對成骨細胞增殖作用如圖6所示。24h時，低、中質量濃度組的Lf可顯著性促進成骨細胞增殖，高質量濃度組(500μg/mL)則極顯著性抑制成骨細胞增殖；48h與72h時，中低質量濃度組與對照組無顯著差異，高質量濃度組顯著性抑制成骨細胞增殖；這說明95℃加熱處理10min對乳鐵蛋白的活性具有明顯影響，趨勢與85℃/10min處理組相似。

Rüegg等[13]研究發現在pH值為6.6時，Lf在65～69℃時開始失活。研究發現Lf的Tm隨pH值減小而降低，當體系pH值由7.0降至3.0時，牛乳乳鐵蛋白(bLf)的Tm由70℃變化為39℃，且bLf的變性是不可逆的。程金波等[14]研究發現不同的溫度與時間的熱處理方式組合可以顯著的影響乳中Lf的活性。有研究表明，巴氏殺菌對bLf結構及抗菌活性基本上沒影響[15]。另外，蛋白質的結構決定其功能。Lf發揮功能過程中可能以骨橋蛋白(OPN)作為運轉載體[16-17]，并主要通過LRP1/2介導的細胞內吞作用進入成骨細胞[18]，這些蛋白間的相互作用也隨著Lf結構的變化而變化。本小組此前的研究報道了Native-Lf的變性溫度為73.1℃，當處理溫度大于73.1℃時，Lf發生結構變化，與OPN和LRP1等的相互作用也將發生改變，活性也將受到影響。因此本研究中65℃/30min和72℃/10s對Lf活性影響較小，85℃/10min和95℃/10min對Lf活性的影響較大，這些熱處理對Lf促成骨活性的影響程度從小到大的順序為72℃/10s＜65℃/30min＜85℃/10min＜ 95℃/10min。

3 結 論

未經加熱處理的乳鐵蛋白具有良好的促進成骨細胞增殖活性，在50～500μg/mL可促進成骨細胞增殖，并呈現劑量依賴關系。一定強度的熱處理將破壞乳鐵蛋白的促成骨活性，隨著熱處理強度的提高，該活性損失程度逐漸增加。65℃/30min和72℃ 10s對Lf的活性無顯著影響，85℃/10min和95℃/10min對Lf成骨活性影響顯著，尤其是對高質量濃度的劑量組。不同時間點，Lf對成骨細胞增殖活性的影響表現不同。

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