利用Caco-2細胞模型評價乳源ACE抑制肽小腸吸收機制的研究進展

祝 倩，郭宇星,*，潘道東,2

(1.南京師范大學金陵女子學院，江蘇 南京 210097；2.寧波大學海洋學院，浙江 寧波 315211)

近年來，隨著人們生活水平的提高，高血壓的發病率呈上升趨勢，全世界大約20%的人受此威脅。高血壓會引起患者心、腦、腎等器官損壞，并會引起糖脂代謝紊亂和糖尿病，嚴重時則會危及生命，因此，抗高血壓藥物的研究引起國內外學者越來越多的重視[1]。

目前，治療高血壓的降壓藥物有多種，如利尿降壓劑、中樞神經和交感神經抑制劑、腎上腺素能受體組滯劑、酶抑制劑、鈣離子拮抗劑和血管擴張劑。血管緊張素轉化酶(angiotensin-Ⅰ converting enzyme，ACE，EC3.4.15.1)抑制劑大多是化學合成的，如卡托普利(Captopril)、依那普利(Enalapril)、賴諾普利(Listinopril)等藥物。這類藥物作用時間短，停藥后血壓易反彈，而且人工合成藥物吸收排泄速度快，會引起咳嗽、味覺喪失、腎臟損傷及血管神經性水腫等副作用[1]。如何通過非藥物療法達到治病、防病的目的，已為越來越多的人所接受。乳源血管緊張素轉化酶(ACE)抑制肽是從乳蛋白水解物或發酵乳制品中提取的ACE抑制肽類物質，作為天然的ACE抑制肽，無副作用，如果長期食用的話，可以起到緩解、防止高血壓的作用，當前講究藥食同源，其越來越受到人們的廣泛關注。但是ACE抑制肽進入腸道后，由于腸道黏膜的低通透性、消化道酶系的降解作用等原因在一定程度上阻礙了肽的吸收[2]，造成了肽的生物利用度低下，所以研究ACE抑制肽在小腸中的吸收機制非常必要。

Caco-2細胞來源于人類結、直腸癌細胞，此細胞生物膜因在結構和生物學性質上與人小腸吸收細胞相似而廣泛用于腸道藥物、肽類等營養物質的吸收機制研究。本文概述乳源ACE抑制肽的研究進展，綜述利用Caco-2細胞模型研究乳源ACE抑制肽在小腸中的轉運機制的概況，旨在為肽類的營養吸收研究提供一定的參考。

1 ACE抑制肽研究進展及活性評價方法

1.1 ACE抑制肽研究進展

血管緊張素轉化酶Ⅰ是一種羧二肽酶，普遍存在于哺乳動物組織中。它能使血管緊張素Ⅰ轉變為有血管收縮調節活性的血管緊張素Ⅱ；同時，它還能使緩激肽失去活性，轉變為沒有活性的緩釋肽，從而使血管平滑肌收縮，使得血壓升高。ACE抑制肽是經過蛋白質分解酶的作用產生的一類具有能抑制ACE活性的多肽物質，它通過抑制ACE的活性而起到降低血壓的作用[3]。

表1 酪蛋白多肽和乳清蛋白多肽的ACE抑制活性及其抗高血壓活性Table 1 ACE-inhibitory and antihypertensive activity of peptides derived from caseins and whey proteins

Ferreira[4]于1965年首次在南美茅頭蝮蛇(Bothrops jararaca)毒液中發現了ACE抑制肽之后，多種ACE抑制肽應運而生。Oshima等[5]最早報道了由食品蛋白質得到的ACE抑制肽，通過對明膠進行酶解獲得了活性較強的ACE抑制肽。近年來，人們發現了乳源ACE抑制肽，表1是已報導的乳源ACE抑制肽[6]。如Nakamura[7]、Yamamoto[8-9]等從發酵乳中提取出2種活性短肽——VPP和IPP，并證明其在體外的ACE抑制活性和降低自發性高血壓大鼠血壓的能力。Lapointe等[10]從β-乳球蛋白酶解物中分離到β-Lg(142～148)，其氨基酸序列是Ala-Leu-Pro-Met-His-Ile-Arg。Maruyama等[11]從牛乳酪蛋白的胰蛋白酶水解物中分離出一種能抑制ACE活性的12肽。這些乳源ACE抑制肽對一些血壓正常的動物或人沒有降壓作用，具有安全性高、無毒副作用的特點[12]。

1.2 評價ACE抑制肽活性的方法

目前評價ACE抑制肽的方法主要為體內法(動物實驗)和體外法。體內法是以原發性高血壓大鼠為實驗對象，通過口服或靜脈注射不同劑量的ACE抑制劑，測定動脈收縮壓的大小，并與對照組進行比較。體外法主要采用兩種方法：一是可見光光度法，即將ACE作用的底物由帶有藍色的FAPGG代替含有馬尿酸的三肽，根據ACE作用后光吸收減弱的原理，通過減弱的程度來評價ACE抑制肽活性；二是色譜法，通過檢測產物中的馬尿酸含量來確定其是否具有ACE抑制活性[13]。

但嚴格來說，ACE抑制肽并不完全等同于降壓肽。降壓肽指的是經過體內或臨床實驗證明確實具有降血壓功能的肽段，而ACE抑制肽則是指體外檢測具有抑制ACE活性的小肽，并不能完全保證其在動物體內能發揮降壓作用。實際上，有些肽的體外ACE抑制活性與體內降壓效果不一致，可能會出現體外檢測抑制活性低的肽卻在體內顯示出強抗高血壓作用，這些肽可能是被體內消化酶水解后生成了強活性的肽而發揮了降血壓的作用[14]。如Miguel等[15]發現多肽經胃蛋白酶、胰酶或者小腸刷狀緣膜肽酶水解后ACE抑制活性下降，但仍然有抗高血壓活性。然而，還有些肽在體外檢測中有較高的ACE抑制活性，但體內檢測卻沒有抗高血壓活性，如Anusha等[16]發現太平洋鱈魚魚蛋白水解物經過胃腸道消化后的ACE抑制活性沒有改變，利用Caco-2細胞作為小腸吸收模型進行魚蛋白水解物的小腸吸收實驗，發現魚蛋白水解物在經過Caco-2細胞后沒有任何的ACE抑制活性，推測這種現象的原因可能是ACE抑制肽沒有被腸道吸收；ACE抑制肽被小腸刷狀緣膜上的肽酶水解后活性完全喪失。因此，研究ACE抑制肽由小腸上皮細胞轉運至血液的機制很有必要。

2 利用Caco-2細胞模型研究乳源ACE抑制肽小腸吸收機制的進展

2.1 Caco-2細胞模型

Caco-2細胞系來源于人類結、直腸癌細胞，在普通的培養條件下就可以在有孔的多聚碳酸酯膜上自發的分化為腸上皮細胞單層，因此可以模擬體內小腸上皮細胞層[17]。Caco-2細胞接種到碳酸聚酯多孔膜等基質上，在適當的培養條件下自發形成有極性的具微絨毛以及緊密連接等類似于小腸上皮細胞分化特征的單細胞層。因此，此細胞可以用來模擬小腸上皮細胞，廣泛用于營養物質及藥物吸收過程中物理和生化屏障的研究。Per等[18]報道了利用Caco-2細胞模型預測不同藥物的跨腸上皮細胞膜的轉運途徑，并得出結論，Caco-2細胞模型可用于鑒定藥物吸收狀況。Kim等[19]通過對比Caco-2細胞體外細胞培養模型和小鼠原位灌注回腸模型研究了肽的吸收特性，觀察到Caco-2細胞體外細胞培養模型和小鼠原位灌注模型的實驗結果有很好的相關性，表明Caco-2細胞模型是研究多肽跨小腸細胞膜轉運很好的實驗系統。

2.2 乳源ACE抑制肽小腸吸收機制的研究進展

2.2.1 利用Caco-2細胞模型研究乳源ACE抑制肽小腸攝入機制

2.2.1.1 營養物質經小腸轉運途徑的類型

小腸是機體內吸收物質的主要部位，物質主要在小腸絨毛上的吸收細胞上進行。小腸單層柱狀上皮細胞面向黏膜側的膜為頂側膜，也稱為刷狀緣膜，面向血液側的膜為側底膜，也稱基底膜。肽轉運系統位于小腸上皮細胞的刷狀緣膜，上皮細胞之間通過緊密連接、間隙連接以及橋粒等方式相互連接。營養物質口服后可通過以下途徑從腸腔進入血液循環：1)通過細胞之間連接的轉運；2)被動的穿越細胞胞質的轉運；3)主動的載體介導的轉運及藥物外流；4)胞飲路徑，如圖1[20]所示。

圖 1 小腸上皮細胞轉運途徑示意圖[20]Fig.1 Schematic diagram of transportation in intestinal epithelial cells[20]

不同營養物質進入小腸有不同途徑，主要和營養物質的類型、結構、親水性等有關，利用Caco-2細胞模型可以研究不同營養物質的攝入途徑。如Caco-2細胞模型可用于載體介導主動轉運的研究，Caco-2細胞有3種主動轉運載體包括二肽載體、P-糖蛋白和寡肽載體。這些載體主要轉運營養物質(氨基酸、葡萄糖、膽酸等)及與營養物質結構類似的化合物。但對于脂溶性較好的營養物質，油水分布系數大，易分布于上皮細胞脂質膜，有報道[21]是通過被動轉運的。

2.2.1.2 乳源ACE抑制肽小腸轉運機制

乳源ACE抑制肽經人體口服攝入后，必須要克服一系列障礙，以活性形式由小腸上皮細胞轉運至血液，進入人體體液循環，才能達到降低血壓的功效。目前，對于乳源ACE抑制肽在小腸中的轉運方式已有一些報道，已發現的乳源ACE抑制肽的轉運途徑有3種，即主動轉運、細胞旁路途徑轉運及胞飲作用轉運，多肽轉運途徑與多肽鏈長度有密切的關系。

有報道[22]認為，二肽和三肽主要是通過人和哺乳動物小腸上皮細胞刷狀緣膜的寡肽轉運蛋白PepT1由主動轉運而吸收的。PepT1的成功克隆，揭示了哺乳動物的腸腔內存在二肽和三肽的特殊轉運系統，這種轉運系統可以介導二肽和三肽的吸收。然而，VPP是發現最早的乳源ACE抑制肽，Satake等[23]利用Caco-2細胞模型研究了其轉運過程，發現VPP雖然是三肽，但并不是通過刷狀緣膜的二肽和三肽轉運載體PepT1轉運至細胞中，而是通過細胞旁路途徑轉運的。因為肽轉運載體競爭性抑制劑Gly-Pro、奧代美寧A(Arphamenine A)和細胞內吞抑制劑氧化苯胂對VPP的轉運沒有顯著的抑制作用，所以胞旁轉運是VPP轉運的主要機制。Tamura等[24]發現Val-Val-Val跨上皮的轉運途徑是通過旁路途徑的被動擴散。

對于大于三肽的寡肽，劉冬等[25]研究了降血壓肽Val-Leu-Pro-Val-Pro(VLPVP)在Caco-2細胞模型中的吸收機制，確定VLPVP主要是通過細胞旁路轉運穿過小腸上皮細胞的。Pappenheimer等[26]已經證明八肽很可能是通過旁路轉運吸收通過腸道上皮細胞。Adson等[27]得出結論，D-Phe-Gly主要是通過旁路轉運的。另外，疏水九肽的跨上皮轉運可能包括胞吞轉運作用，四肽的主要轉運途徑應該是旁路途徑[28]。Quirós等[29]報導了來源于β-酪蛋白的ACE抑制肽LHLPLP的小腸轉運機制，LHLPLP在胞質中被肽酶降解成HLPLP，再通過旁路途徑轉運出細胞。Cakir-Kiefer等[30]對五肽HLPLP的跨膜實驗表明，旁路被動擴散可能是其跨Caco-2細胞單層轉運的主要機制，同時還指出αs1-酪蛋白(αs1-CN 91～97)的小腸轉運途徑也可能是旁路擴散。β-酪蛋白(β-CN (193～209))，是一個有17個氨基酸殘基組成的疏水性、免疫調節活性長肽，Regazzo等[31]使用選擇性抑制劑來評估β-CN (193～209)轉運途徑，發現其是通過胞飲作用轉運的，但也不能排除通過緊密連接的旁路轉運。

從以上研究可發現，大多數多肽在小腸中轉運是通過旁路轉運的被動擴散，被動擴散能否順利進行還與多肽所帶電荷、氫鍵鍵能、疏水性有關。Pauletti等[32]研究了肽的大小和帶電特性對跨Caco-2細胞膜旁路轉運時被動擴散的影響，發現肽帶正電荷會增強旁路跨膜的滲透性，但隨著肽鏈長度增加，凈電荷的影響就會減少。Robert等[33]發現肽被動吸收的一個重要的障礙是要打破水和肽之間的氫鍵，來溶解肽使之進入細胞膜。Chua等[34]觀察3種血管緊張素肽des-Asp-angiotensinⅠ(DAAⅠ)、Angiotensins Ⅲ和Angiotensins Ⅳ跨Caco-2細胞膜的特性，建立了結構和轉運的相關性，得出DAAⅠ是通過被動擴散轉運的，而Angiotensins Ⅲ、Ⅳ是通過一種需能的、主動載體介質轉運，在這3種肽中，DAAⅠ是最疏水的，有最高的氫鍵鍵能。

2.2.2 利用Caco-2細胞模型研究乳源ACE抑制肽在小腸細胞中的滯留代謝

Caco-2細胞具有與小腸上皮細胞相同的細胞極性和緊密連接，存在于小腸細胞刷狀緣的酶，如氨肽酶、堿性磷酸酶、蔗糖酶及γ-谷氨酰轉肽酶也同樣存在于Caco-2細胞中[35]。由于其含有各種代謝酶，因此更接近肽在人體內吸收的實際環境，可用于肽在細胞中的滯留代謝研究。

乳源ACE抑制肽如果要以完整形式由小腸上皮細胞轉運至血液中，還必須抵御小腸腸道刷狀緣膜上的肽酶和胞質肽酶的水解。目前研究發現，乳源ACE抑制肽能否被肽酶水解，與其肽鏈長度和氨基酸組成有關。經報道[36]，刷狀緣膜上的肽酶能夠將寡肽水解成氨基酸、二肽或三肽。對于四肽或以上的肽在刷狀緣膜超過90%被水解，三肽10%～60%，而二肽是10%。如Quirós等[29]報導了來源于β-酪蛋白的ACE抑制肽LHLPLP的小腸轉運機制，LHLPLP在胞質中被肽酶降解成HLPLP。但 Vermeirssen等[37]通過Caco-2細胞研究Ala-Leu-Pro-Met-His-Ile-Arg轉運機制，是在投藥后10min內發生吸收的，這個七肽是完整轉運的。β-酪蛋白(β-CN (193～209))是一個有17個氨基酸殘基組成的長肽，Regazzo等[31]研究發現β-CN(193～209)能抵制小腸刷狀緣膜肽酶的作用。據此推測，肽酶特異性水解不僅與肽鏈長度有關，與多肽的氨基酸組成也有一定關系，Satake等[23]報導X-Pro-Pro、X-Lys-Pro和X-Lys-Trp結構的多肽可以抵御腸道內肽酶的水解。Quirós等[38]發現LHLPLP和LVYPFPGPIPNSLPQNIPP同時具有體外ACE抑制活性和體內的抗血壓能力。研究發現N末端倒數第2位為亮氨酸時可提高ACE抑制活性，C末端位置為精氨酸時可同時提高ACE抑制肽活性和體內抗血壓能力。Zhu Xiaolin等[39]研究了Ala-Phe、Phe-Ile和Ile-Phe轉運后的ACE抑制活性，發現Ala-Phe和Ile-Phe吸收后仍具有ACE抑制活性，但是Phe-Ile吸收后沒有ACE抑制活性，Ile-Phe和其他二肽相比，穿透小腸膜能力最強。

2.2.3 利用Caco-2細胞模型研究乳源ACE抑制肽的外排機制

以往研究肽的小腸吸收主要考慮從腸腔一側(AP側) 攝入。實際上，肽從腸道到達血液，包括AP側攝入和腸壁一側(BL側)外排兩個過程。Caco-2細胞模型也可用于肽外排機制的研究，P-糖蛋白(P-GP)和多藥耐藥蛋白(MRP)是Caco-2細胞中2種主要的轉運蛋白。兩者均為能量依賴性膜蛋白，發揮外排泵作用，可將胞內化合物逆濃度梯度運至胞外，這與體內小腸上皮的外排系統一致。這些外排系統是造成低生物利用度的原因之一[40]。鄭慧娜等[41]采用Caco-2單層細胞模型體外模擬馬氏珠母貝高F值寡肽(PHFP)小腸吸收，得出PHFP溶液在Caco-2細胞中的轉運存在外排泵的作用。劉冬等[25]研究了降血壓肽Val-Leu-Pro-Val-Pro(VLPVP)的外排機制，通過加入P-GP、MRP抑制劑，觀察VLPVP轉運情況，說明VLPVP在吸收過程中的外排主要是MRP介導的。

3 結 語

Caco-2細胞模型是目前應用較廣泛的體外吸收模型，Caco-2細胞模型的應用將人們對肽的吸收、生物轉化和生物利用度等機制的認識提高到了細胞分子水平。用Caco-2細胞模型可以研究乳源ACE抑制肽在小腸中的攝入，細胞中滯留代謝及外排過程。通過利用Caco-2細胞模型研究乳源ACE抑制肽在小腸中的轉運機制，可了解多肽結構(氨基酸組成、肽鏈長度、極性)與多肽生物利用度的關系，據此改善乳源ACE抑制肽口服后生物學效應低下的現象。

大多數乳源ACE抑制肽是親水性的，跨小腸膜轉運方式一般限制在旁路途徑，被限制在這一途徑的肽的生物利用度一般不高，增強多肽疏水性同時降低氫鍵鍵能的化學修飾是很有潛力的增加生物利用度的策略[42]。另外也可以對肽進行化學結構修飾，比如琥珀酰化、乙酰化、胍化可以提高其脂溶性[43]，提高乳源ACE抑制肽的生物利用度。另外，還可以采用乳化、脂質體、微膠囊等技術用可生物降解的聚合體材料將肽包埋，在吸收目標區定點釋放出肽，保護肽免遭腸道酶系的降解；使用蛋白酶抑制劑和吸收增強劑，增強肽在小腸黏膜的通透性，得以提高生物學效應[2]。因此，利用Caco-2細胞研究乳源ACE抑制肽在小腸中的轉運機制(包括攝入與外排)和在人體小腸中的代謝穩定性有重大意義。

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