微生物酶高效異源表達策略的最新研究進展

楊海泉，劉 龍，李江華，堵國成,*，陳 堅

(1.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學生物工程學院，江蘇 無錫 214122；3.江南大學 糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122)

酶作為生物催化劑可應用于多個領域，酶的產率、產量、品質和功能是酶應用于工業中的重要決定因素[1]。酶的高效表達與多個因素相關：宿主的細胞生長特性、表達水平、胞內/胞外表達模式、翻譯后修飾、活性蛋白等。為了實現酶的高效表達，酶表達系統的選擇至關重要。重組酶已在多個宿主中成功表達，如大腸桿菌、芽孢桿菌、酵母、絲狀真菌、乳酸菌[2-6]。由于外源基因或表達宿主性質與功能的多樣性以及在細胞培養過程中不能合理監控其生理變化，目的蛋白基因在表達宿主中很難實現高效表達，酶的工業化生產受到限制。針對上述問題，本文主要總結了用于工業酶過量表達的不同微生物宿主及實現其高效表達的最新方法策略等。

1 不同表達宿主在異源表達酶方面的差異

如表1所示，不同表達系統具有各自相關特點。E. coli表達系統優點為宿主基因組信息清晰、質粒拷貝數高、突變宿主種類多等[7]。芽孢桿菌表達系統優點為具有高效分泌能力、蛋白酶活性低、質粒結構穩定、分泌蛋白可正確折疊、分泌蛋白可溶、分泌蛋白具有生物催化活性[5]。酵母表達系統優點為蛋白翻譯后修飾(如糖基化)、高熱耐受性、高鹽耐受性等[8]。絲狀真菌表達系統優點為可高效表達大分子真核蛋白、超強分泌蛋白能力、食品安全型宿主等[2]。乳酸菌表達系統特點為細胞膜上沒有毒素，是食品或藥品領域安全表達宿主[3]。

同時，不同表達系統在表達蛋白時，所需培養基及表達量方面也具有各自相關特點。E. coli表達系統優點為生長速度快、可高密度發酵、易培養、高產量等。例如，堿性磷酸酶在重組E. coli中表達量最高可達5.2g/L[5]。芽孢桿菌表達系統優點為發酵培養基低廉且寬泛、高效分泌能力等。例如，內聚半乳糖醛酸酶在重組B. subtilis中表達量可達0.8g/L[9]。酵母表達系統優點為菌體生長快速、碳源廉價、高密度發酵、高熱耐受性、高鹽耐受性、高產量、低生產成本等。例如，鼠標膠原在重組P. pastoris中表達蛋白量最高可達14.8g/L；其他重組蛋白量最高可達30g/L[8]。絲狀真菌表達系統優點為易培養、高產量、高表達量等。例如，糖化酶在A. niger中表達產量可達30g/L；同時，T. reesei的蛋白表達量可達100g/L[2]。乳酸菌表達系統雖為食品級宿主，但其表達量低。例如，β-半乳糖苷酶在L. lactis中表達量可達0.225U/mL[10]。

表1 不同酶表達宿主的特點Table 1 Characteristics of different enzyme expression host

不同表達系統在轉化方法方面存在較大差異。宿主轉化方法主要包括化學轉化法和電擊轉化法。E. coli宿主轉化時主要采用化學轉化法，該方法簡單易于操作、轉化效率高；同時，也采用電擊轉化法進行，該方法操作相對比較簡單、轉化效率高[11]。芽孢桿菌宿主常采用化學轉化法，轉化方法相對簡單，轉化效率一般；對于該宿主也采用電擊轉化法進行轉化，轉化方法相對比較簡單易于操作；同時，芽孢桿菌也會采用其他相關方法，如原生質體轉化法、重金屬離子轉化法等[12]。酵母表達系統轉化主要采用電擊轉化方法進行，也有少數采用化學轉化法(如氯化鋰法)進行[13]。絲狀真菌表達系統采用的轉化方法包括原生質體轉化法、醋酸鋰轉化法、電擊轉化法、基因槍轉化法、農桿菌介導轉化法。其中，原生質體轉化法的再生頻率低、周期長；醋酸鋰轉化法的使用范圍窄；電擊轉化法的步驟簡單、效率高；基因槍轉化法價格昂貴；農桿菌介導轉化法的轉化穩定、成功率高、遺傳穩定，為最常用的真菌遺傳轉化法[14]。乳酸菌轉化主要采用電轉化方法進行[10]。

2 異源表達微生物酶的關鍵問題及相關解決方案

微生物酶在異源表達時，常出現蛋白質無法正確折疊、不可溶或折疊后缺少糖基化等修飾問題導致形成無活性蛋白甚至包涵體。包涵體具有蛋白不可溶、蛋白表達量低等缺點。對于表達后出現包涵體的現象，主要出現在重組E. coli表達蛋白情況下，其他表達系統出現包涵體的概率相對較低。包涵體的形成主要由以下條件導致的：表達量過高、蛋白來源于真核系統表達時無法糖基化、錯誤折疊分子、重組蛋白含過多含硫氨基酸、培養條件影響(pH值、溫度)、蛋白質分子間的作用力(離子鍵、疏水鍵、共價鍵等)等。針對上述問題，減少包涵體的形成常需要優化表達體系及相應蛋白。常采用的方法包括：與分子伴侶或折疊酶共表達、降低重組蛋白合成速率、低溫誘導、誘導劑的劑量和誘導時間、培養時添加蛋白可溶性添加劑(多醇類、蔗糖、乙醇等)、采用不同質粒及表達宿主、改變蛋白結構內氨基酸組成[15-16]。針對缺少糖基化的現象，主要出現來源于真核系統中蛋白在原核表達系統中表達時，這樣的蛋白可以更換成真核表達宿主(如酵母、絲狀真菌)[2,8]。

胞內表達或分泌表達對蛋白在異源表達宿主中表達具有重要意義。胞內表達的優點主要包括：高純度、簡單的質粒結構、較高蛋白表達量等。但也有其缺點如：易形成包涵體、最終蛋白表達量低、產品耗費高等。分泌表達的優點為：表達蛋白純化簡單、蛋白不易水解、促進蛋白折疊、蛋白表達量高等；其缺點為信號肽運輸能力有限分泌容易異常、蛋白溶解不易純化等。通過調控蛋白分泌的關鍵因素可以提供蛋白的分泌表達量。調控蛋白分泌的關鍵因素主要包括融合宿主相應信號肽、融合蛋白、共表達分泌蛋白、共表達分子伴侶、添加促進分泌成分、采用不同質粒及宿主、控制發酵條件等[1,2,5,7-8]。

3 微生物酶在大腸桿菌中過量表達策略

E. coli作為酶常用表達宿主之一，為實現酶的過量表達可采用不同的分子操作技術與發酵策略。重組酶的表達調節是一個包括諸多相互元素的復雜系統。表達質粒的構建需要諸多因素，這些因素對于酶的過量表達水平具有關鍵意義。E. coli表達質粒主要包括啟動子、核糖體結合位點(RBS)、轉錄終止子等。采用強啟動子可以促進重組蛋白在E. coli中高效合成。在采用化學誘導型質粒時，采用低溫誘導可以為蛋白重折疊提供足夠的時間實現活性蛋白的表達。轉運終止子可以增強mRNA的穩定性，增加外源蛋白的表達水平。同時，反終止子因素的應用也有利于外源基因在大腸桿菌中的表達。蛋白表達水平的高低與基因的翻譯水平有重要關聯。重組蛋白在E. coli中異源表達會受到密碼子偏好性的制約，稀有tRNA的競爭可以嚴重影響基因的表達水平[17]。非常稀有的精氨酸密碼子AGA和AGG會造成錯誤翻譯，從而導致蛋白表達水平低下。通過全基因合成可優化表達基因，實現優化密碼子和去掉二級結構mRNA[18]。同時，通過對目標基因稀有密碼子進行突變或共表達編碼tRNA基因，可以緩解密碼子偏好性。為了表達可溶性蛋白，主要采用的方法包括低溫培養、表達DnaK/DnaJ (Hsp70)、不同E. coli宿主選擇、改變pH值、高壓減弱疏水作用、共表達分子伴侶、調節細胞質Ca2+、限制生長調節、共表達等。為了提高蛋白分泌水平，采取的方法主要有信號肽優化、突變信號肽、過量表達雙精氨酸轉運(Tat)ABC蛋白、EDTA和溶菌酶的協調效應、洗滌劑、周質空間分子伴侶、融合蛋白、元素(如SDS、甘氨酸、Ca2+、Na+)添加、延長甘氨酸補加率、翻譯調控、葡萄糖球菌核酸酶的19-殘基前導肽等。

多種融合蛋白和分子伴侶均已應用于提高酶的表達水平。GSF融合常應用于提高不同重組蛋白的表達[19]。蛋白SUMO、TrxA或硫氧還蛋白的融合可以顯著提高重組蛋白在E. coli中的表達量[20-22]。通過trpE基因片段在翻譯水平的融合可以顯著提高低表達水平基因的表達量。同時，分子伴侶對于蛋白在胞內的折疊也具有重要意義。通過共表達2個噬菌體T4編碼分子伴侶可成功生產出可溶性蛋白[23]。通過共表達鐮狀瘧疾蟲分子伴侶增強了抗瘧疾藥物靶標環化水解酶的表達量[24]。在發酵優化產酶方面，高密度培養可以實現酶在E. coli中的高效表達。高密度培養的方法包括分批、分批補料、連續培養等。限制高密度培養的制約因素(溶解氧、二氧化碳)降低了細胞生長速率、增加了乙酸的形成、減少了混合效率等。為了降低乙酸的積累，通過代謝工程引入乙酰乳酸合酶可提高重組蛋白的表達量。

4 微生物酶在芽孢桿菌中過量表達策略

B. subtilis是又一優良蛋白基因異源表達系統，該系統可將蛋白分泌至胞外。在系列B. subtilis表達系統中，芽孢菌素調節基因表達系統是最高效的表達系統。多種重組酶在B. subtilis表達系統中成功表達[4]。B. alcalophilus的堿性淀粉酶在B. subtilis中過量表達，表達后酶的產量是野生菌表達量的76倍[4]。分子伴侶PrsA脂蛋白的過量表達可以增強B. strearothermophilus淀粉酶在B. subtilis中的分泌[9]。啟動子系統是B. subtilis表達系統的重要因素。通過Pglv啟動子多核酸下游轉錄區域位點的定點突變可促進其啟動能力。

B. megaterium是一已應用于異源蛋白表達的原核宿主。B. megaterium作為表達宿主具有很多優點，如質粒結構穩定、低蛋白酶活性、培養基廣泛等[5]。多種不同異源蛋白已經成功在B. megaterium中進行表達[25]。角蛋白酶在啟動子PxylA和PamyL的調控下，在B. megaterium中成功表達[26]。為了減弱調節子的抑制作用，調節子DegSU轉錄調控促進了異源淀粉酶在B. megaterium中的高效分泌[27]。

B. brevis也是一個重要的異源蛋白表達宿主，酶異源表達后直接分泌至培養基中高效積累。在B. brevis中異源表達的酶是可溶的、正確折疊的、具有生物催化活性。B. brevis的胞外蛋白酶表達水平低下，所以宿主分泌的異源表達后的酶是穩定的、不易被降解[5]。重組磷脂酰肌醇-磷脂酶在B. brevis宿主中成功過量表達。通過分子工程手段，可以實現蛋白在B. brevis中的高效分泌。例如，真菌蛋白二硫鍵異構酶的表達可以增強B. brevis分泌系統的分泌能力。

5 微生物酶在酵母中過量表達策略

酵母成為重組酶表達的最適宿主之一，具有基因操作、快速生長、翻譯后修飾(如糖基化)等優點。目前，已應用于酶表達的酵母宿主包括：P. pastoris、Saccharomyces cerevisiae、Hansenula polymorpha、Kluyveromyces lactis、Schizosaccharomyces pombe、Yarrowia lipolytica、Arxula adeninivorans、Candida boidinii等[28-34]。為進一步提高重組酶的生產，通過分子工程技術改造酵母宿主獲得多種優良宿主[35]。P. pastoris是不同來源微生物酶過量表達的最常用宿主。應用廣泛的P. pastoris表達宿主包括P. pastoris GS115(營養缺陷型宿主)和P. pastoris SMD1163/1165(蛋白酶缺陷型菌株)。P. pastoris有3種表現型：Mut+、Muts、Mut－。多種重組酶在P. pastoris表達系統中成功表達，如Candida rugosa LIP同工酶在重組P. pastoris中成功表達，產量為在原野生宿主中表達量的10倍[36]。重組酶在P. pastoris中高效表達需具備如下因素：序列最優化、帶有分泌信號肽、合適表達質粒、最優發酵條件等。可以通過優化P. pastoris表達系統，提高其重組酶的表達量。作為快速、便捷表達質粒質粒，pBGP1-DEST和pPICZ alpha-DEST主要應用于重組P. pastoris中分泌蛋白[37]。不同的誘導方式重組酶表達量具有較大影響。由于甲醇具有一定毒性，同時在生產過程中甲醇本身具有一定危險性，所以在發酵方面甲醇誘導不適合于食品領域產品的生產，為此可以采用3-磷酸-甘油醛脫氫酶(GAP)啟動子。P. pastoris高密度發酵產酶所需培養基主要包括基礎鹽培養基、微量元素、氨水、甘油、甲醇等。氨水作為堿性溶液可用于控制pH值，同時在發酵后期可用于提高氮源促進菌體生長。對于重組蛋白生產過程中甘油濃度過高時，甘油會抑制AOX1啟動子的功能[38]。同時，以山梨醇作為共基質具有更為顯著的促進蛋白表達量的效果[18]。由于氧是P. pastoris甲醇誘導發酵過程中的必須因素，所以在甲醇利用發酵過程中需要較高氧傳遞速率[39]。為了提高氧傳遞速率需要高速攪拌和富氧空氣條件，這樣才可能使溶解氧持續保持在合理水平[39]。在高密度發酵過程中，酵母分泌的蛋白酶對于重組酶有一定降解作用，這將嚴重影響酶的產量。為解決上述問題，可以采取如下方法：降低發酵pH值、添加酪蛋白水解物、改變培養基組成等[18,39]。

S. cerevisiae被認為是最安全宿主之一，在該宿主中表達的酶制劑可應用于食品、藥品等領域。據報道，已市場化的尿酸氧化酶主要由宿主S. cerevisiae表達[40]。同時，還有很多重組酶在S. cerevisiae中成功異源表達的實例，例如，C. albicans Pma1p(CaPma1p)在S. cerevisiae中成功高效表達[41]。通過分子改造方法(如融合分子伴侶、基因敲除等)可以提高重組蛋白在S. cerevisiae中高效表達量。據報道，以細胞壁蛋白不同區域作為翻譯融合伴侶，Paenibacillus barcinonensis內切葡聚糖酶在S. cerevisiae中獲得成功表達[42]。同時，途徑調節子Hac1p的調節可激活分泌途徑促進重組蛋白在S. cerevisiae中的分泌。通過S. cerevisiae突變庫篩選，基因MON2的敲除增強了重組熒光素酶分泌[43]。通過改變培養基的成分也可以促進重組S. cerevisiae分泌蛋白。例如，添加含富含氨基酸的培養基可顯著提高S. cerevisiae合成纖維素酶[44]。

H. polymorpha宿主可以合成生產多種酶(如乙醇酸氧化酶、植酸酶等)[45-46]。培養條件(溫度、pH值、培養基組成等)對重組酶表達量高低具有重要影響。據報道，重組葡激酶(rSAK)成功在H. polymorpha中表達，通過發酵優化(溫度、pH值、補料、培養及組成等)后達到最高產量(1g rSAK-2/L)[46]。Y. lipolytica也逐漸應用于大分子重組酶表達、高效分泌等。Saccharomycopisis fibuligera A11酸性蛋白酶基因(AP1)在Y. lipolytica中過量表達，表達量為46.7U/mg[32]。Rhizopus oryzae脂肪酶，在強啟動子XPR2的調控下在Y. lipolytica P01g中異源表達[47]。甲基營養型酵母C. biodinii是一種分泌蛋白生產的高效宿主。乙酰亞精胺氧化酶(ASOD)基因在AOD1啟動子調控下，在C. biodinii中過量表達[34]。K. lactis已經成功應用于表達重組酶制劑如脂肪酶、脫乙酰幾丁質酶、酯酶、半乳糖苷酶、葡糖糖化酶[32,48-50]。少數重組酶在A. adeninivorans中成功表達，如丹寧酸酶在A. adeninivorans中已成功表達[51]。

6 微生物酶在絲狀真菌中過量表達策略

絲狀真菌可為表達宿主用于過量生產、分泌蛋白。絲狀真菌是具有高效分泌蛋白潛力的真核表達系統，能對蛋白進行翻譯后修飾等。隨著生物技術的快速發展，傳統發酵與其他相關產業開始逐漸重視絲狀真菌表達宿主的研究與應用。用于蛋白表達的絲狀真菌包括Aspergillus、Trichoderma、Penicillium、Rhizopus、Fusarium等[52]。絲狀真菌表達的異源蛋白主要分為2類：工業酶制劑和高等生物的基因產物(蛋白藥物等)。絲狀真菌的表達水平除了少數蛋白產量偏高外，其他異源蛋白的產量遠達不到高水平。為此可以在轉錄、翻譯、翻譯后修飾加工、分泌和胞外降解等不同水平進行改造，提高蛋白的表達量。到目前為止，被開發用于重組蛋白生產的絲狀真菌宿主并不多。本節主要探究與分析2個主要宿主Aspergillus和Trichoderm的現狀及前景。

Aspergillus是重要工業重組酶制劑生產絲狀真菌之一。A. niger和T. reesei等幾種重要真菌中發展起來的DNA介導轉化系統開啟了探索以真菌為蛋白表達系統的研究新方向[52]。A. niger和A. oryzae是食品安全型宿主，適合生產食品、藥品級酶制劑[53-54]。多種重組蛋白分別在宿主A. niger或A. oryzae中成功異源表達。糖化酶基因(glaA)已在A. niger中成功過量表達[55]。據報道，序列中的酪氨酸和天冬酰胺組成可提高重組蛋白表達水平[56]。同時，catR啟動子的誘導或抑制作用可用于增強A. niger中重組蛋白的生產[57]。宿主A. oryzae在酶生產方面具有高效生產與分泌能力，也是一株重要蛋白表達宿主。一種新型細菌植酸酶成功在宿主A. oryzae中表達[58]。聚酮合酶(PKS)在啟動子gpdA的作用下，在宿主A. oryzae中成功表達[59]。

Trichoderma屬表達宿主主要包括：T. reesei、T. altroviride、T. vireus。在表達系統T. reesei方面的研究相對較多，但在T. altroviride和T. vireus表達系統方面的研究尚處在起步階段。據報道，纖維二糖水解酶cbh1強啟動子可以提高纖維素酶在宿主T. reesei中異源表達效率[60]。不同表達質粒對酶在宿主T. reesei中異源表達具有重要影響。Lü等[61]構建了2個可應用于大分子酶基因表達的質粒(pWEF31、pWEF3)。在強啟動子T. reesei cel7A (chh1)的調控下，3個來源于Chaetomium thermophilum CBS 730.95的木聚糖內切酶基因(Ct xyn11A、Ct xyn11B、Ct xyn11C)在中T. reesei成功表達[62]。Penicillium oxalicum B3-11內切木聚糖酶基因(PoxynA)在強啟動子pdc的調節下，在宿主Trichoderma reesei中成功表達[63]。

7 微生物酶在乳酸菌中過量表達策略

隨著生物技術、基因組、蛋白組等技術的發展，乳酸菌逐漸成為在重組蛋白高效表達方面非常具潛力宿主之一。乳酸菌細胞膜上沒有毒素，其表達的產物直接與人類健康有關系。因此乳酸菌成為食品安全級微生物，可應用于食品工業和生物制藥等領域重組蛋白表達[64]。關于乳酸菌異源表達蛋白的一些關鍵技術已經相繼出現，主要包括：不同誘導系統、不同表達系統、調控系統、菌株修飾、表達質粒、啟動子、增強誘導、分泌系統等[3,65]。乳酸菌表達系統具有多種食品級選擇標記，主要包括：糖類選擇標記(乳糖選擇標記、D-木糖選擇標記、蔗糖選擇標記等)、細菌素抗性選擇標記、營養缺陷型選擇標記、抗金屬離子選擇標記和噬菌體選擇標記等[66-67]。

在乳酸菌中，L. lactis是一株目前乳酸菌中常用于重組蛋白表達的菌株。多種重組蛋白已經在L. lactis中成功異源表達。過敏原蛋白基因與質粒pNSH重組后，在重組L. lactis NZ9000中成功表達[68]。同時，已有不同誘導系統用于在L. lactis中重組蛋白表達。例如，乳酸鏈球菌肽誘導型調控基因廣泛應用于L. lactis的誘導系統中[69]，這個系統提供了嚴謹的控制表達系統和蛋白表達系統。另外，出現了一些選擇性誘導系統。Bifi dobacterium longum NRRL B-41409 L-阿拉伯糖異構酶(L-AI)被克隆后，在L. lactis中通過磷酸-消耗-誘導表達系統成功表達[70]。L. brevis S蛋白基因在木糖誘導表達系統(XIES)轉錄調控下成功表達后并分泌至胞外[71]。研究發現，增強包含5’-非翻譯前導序列mRNA的穩定性可以提高重組淀粉酶在L. lactis中的表達量[72]。分泌水平是提高重組酶在L. lactis中高效表達的另一個關鍵因素。Baradaran等[73]成功將2條Pediococcus pentosaceus信號肽與蛋白融合在L. lactis中表達，成功獲得分泌蛋白。在L. lactis表達系統中采用啟動子Pnisz和信號肽SPUsp，可以獲得可溶性、分泌蛋白。例如，Liang等[74]將納豆激酶基因轉入L. lactis中成功表達后，產生的重組蛋白分泌到培養基中，酶活力可達41.7U/mL。Drouault等[75]利用乳酸乳球菌NICE表達系統成功誘導表達了豬葡萄球菌脂肪酸，口服給藥用于治療脂肪痢。

8 結 語

重組微生物酶制劑已分別可以在細菌、真菌等微生物表達系統中過量表達。分析發現，E. coli表達系統在微生物酶制劑表達系統中仍占支配地位。芽孢桿菌表達系統作為高效分泌宿主主要用于重組酶分泌表達。酵母作為真核表達宿主可快速利用簡單碳源生長，蛋白表達水平高，同時其表達水平亦可通過調節培養基組成成分進一步提高。部分重組酶可在絲狀真菌表達系統中高效表達與分泌。雖然乳酸菌可作為食品安全型表達宿主用于食品工業和醫藥領域酶制劑表達，但該宿主機理研究并不完善仍需要進一步研究。隨著技術不斷發展，微生物酶制劑應用領域也將越來越廣。這對酶制劑表達與生產的需要亦是多層次的，主要包括酶高質量、高品質、高效催化等。然而，重組微生物酶的高效生產需要高通量表達技術的支持與協助。同時，在系統水平方面，需要蛋白組學方面的綜合覆蓋。因此，在將來發展過程中，只有將基因篩選和表達宿主構建與工業發酵技術及后基因組技術相結合，才可能獲得重組酶高效表達系統。

[1] SANCHEZ S, DEMAIN A. Special issue on the production of recombinant proteins[J]. Biotechnology Advances, 2012, 30(5)： 1100-1101.

[2] WARD O P. Production of recombinant proteins by filamentous fungi[J]. Biotechnology Advance, 2012, 30(5)： 1119-1139.

[3] GARCíA-FRUITóS E. Lactic acid bacteria： a promising alternative for recombinant protein production[J]. Microbial Cell Factories, 2012, 11：157. doi：10.1186/1475-2859-11-157.

[4] YANG Haiquan, LIU Long, LI Jianghua, et al. Heterologous expression, biochemical characterization, and overproduction of alkaline alpha-amylase from Bacillus alcalophilus in Bacillus subtilis[J]. Microbial Cell Factories, 2011, 10： 77. doi：10.1186/1475-2859-10-77.

[5] TERPE K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production： from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2006, 72(2)： 211-222.

[6] KCHOU C P. Engineering cell physiology to enhance recombinant protein production in Escherichia coli [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2007, 76(3)： 521-532.

[7] MAKRIDES S C. Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli[J]. Microbiological Reviews, 1996, 60(3)： 512-538.

[8] CELIK E, CALIK P. Production of recombinant proteins by yeast cells [J]. Biotechnology Advance, 2012, 30(5)： 1108-1118.

[9] VITIKAINEN M, HYYRYL?INEN H L, KIVIM?KI A, et al. Secretion of heterologous proteins in Bacillus subtilis can be improved by engineering cell components affecting post-translocational protein folding and degradation[J]. Journal of Applied Microbiology, 2005, 99(2)： 363-375.

[10] ZHANG W, WANG C, HUANG C Y, et al. Construction and secretory expression of β-galactosidase gene from Lactobacillus bulgaricus in Lactococcus lactis[J]. Biomedical and Environmental Sciences, 2012, 25(2)： 203-209.

[11] YU H M, TYO K, ALPER H, et al. A high-throughput screen for hyaluronic acid accumulation in recombinant Escherichia coli transformed by libraries of engineered sigma factors[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2008, 101(4)： 788-796.

[12] 夏雨. 枯草芽孢桿菌食品級表達系統的構建和分泌表達研究[D]. 無錫： 江南大學, 2007.

[13] 諸葛斌. 堿性果膠酶裂解酶基因工程菌的構建、高表達及酶學性質研究[D]. 無錫： 江南大學, 2007.

[14] 李娟, 楊金奎, 梁連銘, 等. 絲狀真菌遺傳轉化系統研究進展[J]. 江西農業大學學報, 2006, 28(4)： 516-520.

[15] 艾恒, 莫書榮, 魯波. 包涵體研究進展[J]. 中國醫學文摘·內科學, 2006, 27(2)： 109-111.

[16] 鄺愛麗, 陳圓圓, 彭志峰, 等. 包涵體的形成原因及其處理方法[J]. 上海畜牧獸醫通訊, 2009(1)： 62-63.

[17] BURGESS-BROWN N A, SHARMA S, SOBOTT F, et al. Codon optimization can improve expression of human genes in Escherichia coli： a multi-gene study[J]. Protein Expression and Purifi cation, 2008, 59(1)： 94-102.

[18] YANG H Q, LIU L, SHIN H, et al. Comparative analysis of heterologous expression, biochemical characterization optimal production of an alkaline α-amylase from alkaliphilic Alkalimonas amylolytica in Escherichia coli and Pichia pastoris[J]. Biotechnology Progress, 2012, 29(5)： 39-47.

[19] ALFASI S, SEVASTSYANOVICH Y, ZAFFARONI L, et al. Use of GFP fusions for the isolation of Escherichia coli strains for improved production of different target recombinant proteins [J]. Journal of Biotechnology, 2011, 156(1)： 11-21.

[20] LIAN J Z, DING S H, CAI J, et al. Improving aquaporin Z expression in Escherichia coli by fusion partners and subsequent condition optimization[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2009, 82(3)： 463-470.

[21] LEE C D, SUN H C, HU S M, et al. An improved SUMO fusion protein system for effective production of native proteins[J]. Protein Science, 2008, 17(7)： 1241-1248.

[22] TSUNODA Y, SAKAI N, KIKUCHI K, et al. Improving expression and solubility of rice proteins produced as fusion proteins in Escherichia coli[J]. Protein Expression and Purifi cation, 2005, 42(2)： 268-277.

[23] BARTUAL S G, GARCIA-DOVAL C, ALONSO J, et al. Twochaperone assisted soluble expression and purification of the bacteriophage T4 long tail fi bre protein gp37[J]. Protein Expression and Purifi cation, 2010, 70(1)： 116-121.

[24] STEPHENS L L, SHONHAI A, BLATCH G L. Co-expression of the plasmodium falciparum molecular chaperone, PfHsp70, improves the heterologous production of the antimalarial drug target GTP cyclohydrolase I, PfGCHI[J]. Protein Expression and Purification, 2011, 77(2)： 159-165.

[25] GAMER M, STARNMEN S, BIEDENDIECK R, et al. Bacillus megaterium： an alternative expression system[J]. Journal of Biotechnology, 2007, 131(Suppl 2)： 220-220.

[26] RADHA S, GUNASEKARAN P. Sustained expression of keratinase gene under PxylA and PamyL promoters in the recombinant Bacillus megaterium MS941[J]. Bioresource Technology, 2008, 99(13)： 5528-5537.

[27] BORGMEIER C, BIEDENDIECK R, HOFFMANN K, et al. Transcriptome profiling of degU expression reveals unexpected regulatory patterns in Bacillus megaterium and discloses new targets for optimizing expression[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2011, 92(3)： 583-596.

[28] BOMHOLT J, HELIX-NIELSEN C, SCHARFF-POULSEN P, et al. Recombinant production of human aquaporin-1 to an exceptional high membrane density in Saccharomyces cerevisiae[J]. PloS ONE, 2013, 8(2)：e56431. doi：10.1371/journal.pone.0056431.

[29] VORONOVSKY A Y, RYABOVA E B, VERBA E V, et al. Expression of xylA genes encoding xylose isomerases from Escherichia coli and Streptomyces coelicolor in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha[J]. FEMS Yeast Research, 2005, 5(11)： 1055-1062.

[30] ZHOU X X, CHANDARAJOTI K, TRUONG QUANG P, et al. Expression of heparan sulfate sulfotransferases in Kluyveromyces lactis and preparation of 3’-phosphoadenosine-5’-phosphosulfate [J]. Glycobiology, 2011, 21(6)： 771-780.

[31] KUMAR R, SINGH J. Expression and secretion of a prokaryotic protein streptokinase without glycosylation and degradation in Schizosaccharomyces pombe [J]. Yeast, 2004, 21(16)： 1343-1358.

[32] YU X J, CHI Z, WANG F, et al. Expression of the acid protease gene from Saccharomycopsis fibuligera in the marine-derived Yarrowia lipolytica for both milk coltting and single cell protein production [J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2013, 163(7)： 1993-2003.

[33] BOEER E, PIONTEK M, KUNZE G. XplorA (R) 2： an optimized transformation/expression system for recombinant protein production in the yeast Arxula adeninivorans[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2009, 84(3)： 583-594.

[34] NISHIKAWA M, HAGISHITA T, YURIMOTO H, et al. Primary structure and expression of peroxisomal acetylspermidine oxidase in the methylotrophic yeast Candida boidinii[J]. FEBS Letters, 2000, 476(3)： 150-154.

[35] LIU Y P, PAN J F, WEI P L, et al. Effi cient expression and purifi cation of recombinant alcohol oxidase in Pichia pastoris[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2012, 17(4)： 693-702.

[36] FERRER P, ALARCóN M, RAMóN R, et al. Recombinant Candida rugosa LIP2 expression in Pichia pastoris under the control of the AOX1 promoter[J]. Biochemical Engineering Journal, 2009, 46： 271-277.

[37] SASAGAWA T, MATSUI M, KOBAYASHI Y, et al. Highthroughput recombinant gene expression systems in Pichia pastoris using newly developed plasmid vectors[J]. Plasmid, 2011, 65(1)： 65-69.

[38] XIE J, ZHOU Q, DU P, et al. Use of different carbon sources in cultivation of recombinant Pichia pastoris for angiostatin production[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2005, 36(2)： 210-216.

[39] WANG Y, WANG Z, DU G, et al. Enhancement of alkaline polygalacturonate lyase production in recombinant Pichia pastoris according to the ratio of methanol to cell concentration[J]. Bioresource Technology, 2009, 100(3)： 1343-1349.

[40] DEMAIN A L, VAISHNAV P. Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms[J]. Biotechnology Advances, 2009, 27(3)： 297-306.

[41] KENIYA M V, CANNON R D, NGUYEN A, et al. Heterologous expression of Candida albicans Pma1p in Saccharomyces cerevisia [J]. FEMS Yeast Research, 2013, 13(3)： 302-311.

[42] MORMENEO M, JAVIER PASTOR F I, ZUECO J. Efficient expression of a Paenibacillus barcinonensis endoglucanase in Saccharomyces cerevisiae[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2012, 39(1)： 115-123.

[43] KANJOU N, NAGAO A, OHMIYA Y, et al. Yeast mutant with efficient secretion identified by a novel secretory reporter, Cluc[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2007, 358(2)： 429-434.

[44] van RENSBURG E, den HAAN R, SMITH J, et al. The metabolic burden of cellulase expression by recombinant Saccharomyces cerevisiae Y294 in aerobic batch culture[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2012, 96(1)： 197-209.

[45] WANG H, SONG H L, WANG Q, et al. Expression of glycoproteins bearing complex human-like glycans with galactose terminal in Hansenula polymorpha[J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2013, 29(3)： 447-458.

[46] MOUSSA M, IBRAHIM M, EI GHAZALY M, et al. Expression of recombinant staphylokinase in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha[J]. BMC Biotechnology, 2012, 12： 96. doi：10.1186/1472-6750-12-96.

[47] YUZBASHEV T V, YUZBASHEVA E Y, VIBORNAYA T V, et al. Production of recombinant Rhizopus oryzae lipase by the yeast Yarrowia lipolytica results in increased enzymatic thermostability[J]. Protein Expression and Purifi cation, 2012, 82(1)： 83-89.

[48] van OOYEN A J J, DEKKER P, HUANG M, et al. Heterologous protein production in the yeast Kluyveromyces lactis[J]. FEMS Yeast Research, 2006, 6(3)： 381-392.

[49] ROCHA S N, ABRAH?O-NETO J, CERDáN M E, et al. Heterologous expression of a thermophilic esterase in Kluyveromyces yeasts[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2011, 89(2)： 375-385.

[50] KUMARI A, GUPTA R. Extracellular expression and characterization of thermostable lipases, LIP8, LIP14 and LIP18, from Yarrowia lipolytica[J]. Biotechnology Letters, 2012, 34(9)： 1733-1739.

[51] B?ER E, BREUER F S, WENIGER M, et al. Large-scale production of tannase using the yeast Arxula adeninivorans[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2011, 92(1)： 105-114.

[52] 鐘耀華, 王曉利, 汪天虹. 絲狀真菌高效表達異源蛋白研究進展[J]. 生物工程學報, 2008, 24(4)： 531-540.

[53] GAUTHIER T, WANG X, SIFUENTES J, et al. Trypacidin, a sporeborne toxin from Aspergillus fumigatus, is cytotoxic to lung cells[J]. PLoS One, 2012, 7(2)： e29906. doi： 10.1371/journal/.pone.0029906.

[54] RAMAMOORTHY V, SHANTAPPA S, DHINGRA S, et al. veAdependent RNA-pol II transcription elongation factor-like protein, RtfA, is associated with secondary metabolism and morphological development in Aspergillus nidulan[J]. Molecular Microbiology, 2012, 85(4)： 795-814.

[55] KWON M J, JORGENSEN T R, NITSCHE B M, et al. The transcriptomic fingerprint of glucoamylase over-expression in Aspergillus niger[J]. BMC Genomics, 2012, 13： 701. doi：10.1186/1471-2164-13-701.

[56] van den BERG B A, REINDERS M J T, HULSMAN M, et al. Exploring sequence characteristics related to high-level production of secreted proteins in Aspergillus niger[J]. PLoS One, 2012, 7(10)： e45869.doi： 10.1371/journal/.pone.0045869.

[57] SHARMA R, KATOCH M, GOVINDAPPA N, et al. Evaluation of the catalase promoter for expressing the alkaline xylanase gene (alx) in Aspergillus niger[J]. FEMS Microbiology Letters, 2012, 327(1)： 33-40.

[58] ALMEIDA F N, SULABO R C, STEIN H H, et al. Effects of a novel bacterial phytase expressed in Aspergillus oryzae on digestibility of calcium and phosphorus in diets fed to weanling or growing pigs[J]. Journal of Animal Science and Biotechnology, 2013, 4(1)： 8. doi：10.1186/2049-1891-4-8.

[59] PUNYA J, TACHALEAT A, WATTANACHAISAEREEKUL S, et al. Functional expression of a foreign gene in Aspergillus oryzae producing new pyrone compounds[J]. Fungal Genetics and Biology, 2013, 50： 55-62.

[60] ZOU Gen, SHI Shaohua, JIANG Yaning, et al. Construction of a cellulase hyper-expression system in Trichoderma reesei by promoter and enzyme engineering[J]. Microbial Cell Factories, 2012, 11：21. doi：10.1186/1475-2859-11-21.

[61] Lü D, WANG W, WEI D. Construction of two vectors for gene expression in Trichoderma reesei [J]. Plasmid, 2012, 67(1)： 67-71.

[62] MANTYLA A, PALOHEIMO M, HAKOLA S, et al. Production in Trichoderma reesei of three xylanases from Chaetomium thermophilum： a recombinant thermoxylanase for biobleaching of kraft pulp[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2007, 76(2)： 377-386.

[63] WANG J, MAI GQ, LIU G, et al. Molecular cloning and heterologous expression of an acid-stable endoxylanase gene from Penicillium oxalicum in Trichoderma reesei[J]. Journal of Microbiology and Biotechnology, 2013, 23(2)： 251-259.

[64] 王瑩, 胡桂學. 食品級乳酸菌表達系統的研究進展[J]. 中國畜牧獸醫, 2010, 37(7)： 80-83.

[65] 張虎成, 陳薇. 食品級乳酸菌表達系統研究進展[J]. 生物技術通訊, 2007, 18(2)： 345-347.

[66] 陳蕞, 陳建華. 乳酸菌表達系統在生化藥物研究中的應用[J]. 藥學進展, 2008, 32(12)： 529-535.

[67] 郝鳳奇, 楊桂連, 葉麗萍, 等. “食品級”乳酸菌表達載體系統的應用[J]. 中國預防獸醫學報, 2008, 30(10)： 824-830.

[68] SHIGEMORI S, YONEKURA S, SATO T, et al. Expression of the immunoreactive buckwheat major allergenic storage protein in Lactococcus lactis[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2013, 97(8)： 3603-3611.

[69] MORELLO E, BERMUDEZ-HUMARAN L, LLULL D, et al. Lactococcus lactis an efficient cell factory for recombinant protein production and secretion[J]. Journal of Molecular and Microbiology Biotechnology, 2008, 14(1/3)： 48-58.

[70] SALONEN N, NYYSSOLA A, SALONEN K, et al. Bifi dobacterium iongum l-arabinose isomerase-overexpression in Lactococcus lactis, purification, and characterization [J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2012, 168(2)： 392-405.

[71] HOLLMANN A, SAVIELLO M, DELFEDERICO L, et al. Tight controlled expression and secretion of Lactobacillus brevis SlpA in Lactococcus lactis[J]. Biotechnology Letters, 2012, 34(7)： 1275-1281.

[72] NARITA J, ISHIDA S, OKANO K, et al. Improvement of protein production in lactic acid bacteria using 5'-untranslated leader sequence of slpA from Lactobacillus acidophilus[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2006, 73(2)： 366-373.

[73] BARADARAN A, SIEO C C, FOO H L, et al. Cloning and in silico characterization of two signal peptides from Pediococcus pentosaceus and their function for the secretion of heterologous protein in Aspergillus oryzae[J]. Biotechnology Letters, 2013, 35(2)： 233-238.

[74] LIANG X, ZHANG L, ZHONG J, et al. Secretory expression of a heterologous nattokinase in Lactococcus lactis[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2007, 75(1)： 95-101.

[75] DROUAULT S, CORTHIER C, EHRLICH S D, et al. Expression of the Staphylococcus hyicus lipase in Lactococcus lactis[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66(2)： 588-598.