食品蛋白質的糖基化反應：美拉德反應或轉谷氨酰胺酶途徑

宋春麗，趙新淮*

(1.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.東北農業大學 乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030)

食品蛋白質是人類和動物必需的營養素，它的一些功能特性如溶解性、乳化性、起泡性、膠凝性等，是賦予食品良好的質構、穩定性和加工特性的重要內在因素。但是，任何一種單一來源的天然蛋白質，不可能具有上述的所有這些優良功能性質。因而，蛋白質改性技術成為賦予食品蛋白質某些優良特性的必要手段。

食品蛋白質的糖基化修飾，是將親水性的糖類物質以共價鍵連接的方式導入食品蛋白質分子之中，使修飾產物即糖蛋白既具有蛋白質的大分子特性，又具有糖類物質的親水特性。研究發現，糖蛋白表現出優越的乳化能力，并且在溶解性、膠凝性、流變學特性、抗氧化性、熱穩定性、抗菌性等功能特性方面，也有不同程度的提高。可以說，食品蛋白質的糖基化修飾是對其功能性質的一種有效改善。

蛋白質的糖基化，作為開發功能性配料的一個有效手段，是食品蛋白質研究的熱點問題之一。美拉德反應(Maillard reaction)是食品蛋白質糖基化修飾的途徑之一，近十幾年中被眾多的科學家采用，已有效的改善蛋白質的功能性質。同時，另一種蛋白質糖基化途徑——轉谷氨酰胺酶催化(transglutaminase)的蛋白質糖基化，最近已經被成功的應用于酪蛋白和大豆蛋白的糖基化，顯示出其應用前景。基于蛋白質功能性質與食品品質的關系，以及糖蛋白優異功能特性的應用潛力，本文綜述了蛋白質美拉德反應糖基化和轉谷氨酰胺酶催化途徑，并對反應機制、產物結構和功能性質變化等進行簡單討論和介紹。

1 美拉德反應途徑

1.1 美拉德反應的化學機制

美拉德反應是普遍存在于食品體系、涉及到蛋白質和碳水化合物的一個反應，是醛、酮、還原糖以及脂肪氧化生成的羰基化合物與胺類、氨基酸、肽、蛋白質甚至氨水中的氨基之間的反應。該反應是法國生物化學家Louis Camille Maillard于1912年發現。該反應比較復雜，包括縮合、降解、裂解、聚合等一系列反應[1]。美拉德反應的第一步，是還原糖的羰基和氨基酸的氨基發生的縮合反應，生成糖基化產物(即糖蛋白)。然后，形成的氨基糖經Amadori和Heyns重排，得到糖醛類、還原酮類或脫氫還原酮類等中間產物。最后，經過一系列反應形成各種化合物，包括類黑精物質。

1.2 食品蛋白質的糖基化與功能性質變化

從20世紀90年代開始，食品科學家開始致力于利用美拉德反應對食品蛋白質進行糖基化。所研究的蛋白質包括酪蛋白、卵白蛋白、乳蛋白、β-乳球蛋白、牛血清白蛋白、肌原纖維蛋白、血漿蛋白、面筋蛋白、大豆蛋白和溶菌酶等。研究發現，糖基化修飾產物的功能性質都有不同程度的改善。

1.2.1 溶解性質

美拉德反應將糖基通過共價鍵連接而導入食品蛋白質分子之中。所連接的糖基分子中，其羥基的親水特性能夠顯著的提高蛋白質的溶解性[2]。研究結果表明，在60℃、相對濕度79%的條件下，隨著反應時間的延長，部分水解的面筋蛋白與糊精的美拉德反應產物，其溶解性逐漸增加，而且反應3周后的產物在pH2～12的范圍內保持良好的溶解性，如果只將反應物進行簡單混合則不會出現這些結果[3]。大豆蛋白與阿拉伯膠進行美拉德反應，同樣可以提高蛋白質的溶解性。Mu等[4]研究發現，濕熱法制備的大豆蛋白-阿拉伯膠共聚物，在等電點條件下的溶解性增加了近40%。卵白蛋白與葡萄糖、甘露糖在干熱條件下(50℃、相對濕度65%)反應10d，所得的產物能夠完全溶于pH7.0的磷酸鹽緩沖液[5]。

利用美拉德反應糖基化改善蛋白質的溶解性時，糖的種類影響較大。魚肌原纖維蛋白與葡萄糖或者海藻低聚糖在40℃、相對濕度65%條件下反應24h，所得糖蛋白若要達到相似的溶解度(如在0.16mol/L的NaCl中溶解度達到50%左右)，前者參與反應的賴氨酸為6.8%，后者則為28.2%[6]。此外，Saeki等[7]研究鯉魚肌原纖維蛋白質的葡萄糖糖基化時，發現當蛋白質中17%的賴氨酸參與美拉德反應時，61%的肌球蛋白或82%的肌動蛋白能夠溶解在0.1mol/L的NaCl溶液中。

1.2.2 乳化性質

對于糖蛋白，它的蛋白質部分可以有效的吸附在油-水界面上，降低界面張力，所導入的糖基部分(特別是多糖分子)能夠在膜的周圍形成立體網絡狀結構，增加膜的厚度和機械強度，所以，有利于乳化性質的提高。有研究結果證實，美拉德反應產物的乳化性優于某些商業的乳化劑。在60℃、79%的相對濕度條件下，得到的血漿蛋白和半乳甘露聚糖共聚物，其乳化能力是血漿蛋白的1.4倍，并且乳化穩定性增加了10倍[8]。溶菌酶與半乳甘露聚糖干熱反應2周后，產物的乳化能力隨著半乳甘露聚糖分子質量(3.5～6.0、6.0～12、24kD)的增加而增加；同時，相應的3種美拉德產物的乳濁液穩定時間分別為：小于1min(與溶菌酶的乳化穩定時間相近)、1.7min、大于25min[9]。這個結果表明，糖基分子的大小對乳化性質產生了重要的影響。Babiker等[10]的研究也表明，增加糖鏈長度能夠改善糖基化產物的乳化能力；谷蛋白的胰凝乳蛋白酶水解物與殼聚糖在干熱條件下反應15d得到的糖蛋白，在酸性pH值條件下，分子質量高的殼聚糖更能夠提高乳化能力(4倍左右)。此外，增加糖基的導入量也能夠提高糖蛋白的乳化能力。如果半乳甘露聚糖的導入量增加(從1mol增加至2mol)，溶菌酶-半乳甘露聚糖共聚物的乳化能力也得到提高[9]。大豆分離蛋白與魔芋膠的干熱法制得的美拉德產物，也具較好的乳化性質[11]。

反應底物的配比，即蛋白質與糖基的配比，這將一定程度上決定糖基的導入量，進而會影響到糖蛋白的乳化性能。大豆分離蛋白和右旋糖苷在60℃、按3：1的質量比反應15d，所得糖蛋白質量比1：1得到的糖蛋白具有最好的乳化能力[12]。

當然，蛋白質的美拉德反應產物除了具有更好的乳化能力外，其他的一些功能特性也可能同時得到改善。60℃加熱β-乳球蛋白與單糖(阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖或核糖)或二糖(乳糖)的混合物，得到的糖蛋白在乳化性、溶解性、起泡性及熱穩定性方面，均有不同程度的提高[13]。

1.2.3 膠凝性質

許多研究結果表明，美拉德反應能夠增加蛋白質凝膠強度。例如，卵白蛋白與葡萄糖在55℃、相對濕度35%的條件下反應，利用產物形成熱誘導凝膠，發現該凝膠的凝膠斷裂強度和持水性都隨著加熱時間的延長而增加[14]。卵白蛋白與半乳甘露聚糖的美拉德反應產物，在較寬pH值范圍(pH3或pH7～9)和低離子強度(NaCl濃度小于100mmol/L)條件下，也能制得堅實而透明的熱誘導凝膠[15]。

糖的種類對糖蛋白的膠凝性質影響很大。乳糖與乳清濃縮蛋白的美拉德產物，相比乳清濃縮蛋白，需要更長的時間和更高的溫度才能形成凝膠，同時，凝膠的斷裂強度減小；與此不太一致的是，核糖與乳清濃縮蛋白反應得到的美拉德產物，其凝膠的斷裂強度和凝膠彈性卻得到增強[16]。

不過，也有研究結果表明美拉德反應不會明顯的改變蛋白的膠凝性，牛血清白蛋白就是一個特例。牛血清白蛋白和牛血清白蛋白的木糖共聚物的酸誘導凝膠的性質表現出許多相似點，二者都能在較低濃度下形成凝膠，形成凝膠后pH值都下降到4.9，并且凝膠表現出相似的黏彈性[17]。

1.2.4 流變學特性

流變學是食品蛋白質的重要的功能性質之一，影響著加工食品的質構特性。Corzo-Martínez等[18]的研究發現，糖基化酪蛋白(糖基為半乳糖、乳糖、葡聚糖)的表觀黏度，會隨著糖基化反應程度的增加而增加，在50℃條件下酪蛋白與半乳糖反應48h后，糖基化酪蛋白具有最大的表觀黏度；此外，糖基化酪蛋白的彈性模量也隨著糖基化反應程度的增加而增加。Oliver等[19]的研究結果也表明，美拉德反應能夠增加產物的黏度，在60℃、相對濕度67%條件下，酪蛋白酸鈉和果糖反應48h后，黏度增加了24倍；酪蛋白酸鈉、果糖、菊粉按照質量比1：1：0.2反應，產物的黏度則可以增加15倍。一個實際應用的例子是：將大豆分離蛋白與葡聚糖在干熱條件反應，制得的美拉德產物加入到自制的色拉醬中，產品具有更好的流變性[20]。

1.2.5 熱穩定性

美拉德反應造成蛋白質與多糖的共價結合，抑制了蛋白質與蛋白質之間的相互作用，從而可以提高蛋白質的熱穩定性。在pH 5、85℃條件下，β-乳球蛋白與葡聚糖發生美拉德反應后，蛋白質的熱穩定性提高[21]。血漿蛋白的半乳甘露聚糖糖基化產物，在80℃熱處理30min，仍然具有較好的乳化能力[8]。在pH 7.5、50℃熱處理6h，鯉魚肌原纖維蛋白及其與葡聚糖的美拉德產物，在濁度及溶解性變化明顯不同：前者濁度明顯增加，而后者的濁度增加較小；前者中的不溶性蛋白質占63%，而后者中僅有10%[22]。

1.2.6 其他性質

蛋白質的糖基化反應可以提高蛋白質的抗氧化性。Nakamura等[23]通過美拉德反應，將糊精共價導入卵清蛋白中，糖基化的蛋白具有更好的抗氧化能力。在濕熱法(80℃、12h)條件下酪蛋白水解物和葡萄糖反應，產物清除DPPH自由基的能力增強[24]。Chevalier等[25]的研究也表明，美拉德糖基化蛋白具有較好的抗氧化性。不過，筆者認為，蛋白質糖基化后抗氧化活性的提高，應該是與其中所含的美拉德反應后期產物關系更大，與糖基化蛋白質本身的關系不大。

蛋白質的美拉德反應對其致敏作用也存在影響作用，但是研究結果不一致。例如，β-乳球蛋白的糖基化修飾降低了致敏作用[26]，而花生蛋白的糖基化修飾增加致敏作用[27]。所以，這一方面還有待進一步的研究。

1.3 蛋白質的糖基化修飾與結構變化

糖蛋白的糖基化修飾是在蛋白質分子的側鏈引入糖基，所以勢必對蛋白質的結構產生影響。對糖基化蛋白結構的研究，有利于了解糖基化蛋白功能性質變化的因果關系。不過，相對于對糖基化蛋白功能性質的研究，對糖基化蛋白結構的研究較少。目前，對糖基化蛋白結構的相關研究，主要是對蛋白質的一級結構、二級結構以及蛋白質的微觀結構的研究。

1.3.1 微結構變化

目前，主要利用掃描電子顯微鏡、透射電鏡、原子力顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡等手段研究微結構。Niu等[28]利用掃描電子顯微鏡，分析了葡聚糖的導入對小麥胚芽蛋白微結構的影響，結果顯示，小麥胚芽蛋白的微結構從大的、不平坦、無規則的顆粒變成細條形的顆粒，而且糖基化反應后許多小麥胚芽蛋白的粒子趨于伸展。Zhu等[29]利用透射電鏡發現乳清蛋白的粒子大小為3～5nm，而乳清蛋白與葡聚糖美拉德反應產物的粒子大小則增大到15～30nm。Mu等[30]利用β-酪蛋白與葡聚糖(分子質量為10kD)，在物質的量比1：8下反應24h得到糖蛋白，利用原子力顯微鏡分析，發現該蛋白典型顆粒的直徑是110nm，高度為10nm。Zhang等[31]用激光共聚焦顯微鏡分析乳化液滴的大小，發現由β-伴大豆球蛋白-葡聚糖的美拉德反應產物形成的乳化液滴較小(0.1～10μm)，絮凝程度減弱，這一結果還證實乳濁液的穩定性。

1.3.2 一級結構變化

電噴霧電離質譜(ESI-MS)和基質輔助激光解吸-電離飛行時間質譜(MALDI-MS)，能夠精確測定蛋白質與糖基的交聯位點，是研究糖基化蛋白結構的有效手段。Oliver等[32]綜述了這2種方法在乳蛋白美拉德糖基化分析中的應用。Fenaille等[33]則利用ESI-MS和MALDI-MS，確定了β-乳球蛋白與乳糖或半乳糖的糖基化位點；他們發現MALDI-MS能更加有效的確定產物的糖基化位點，賴氨酸是主要的糖基化位點，隨后是α-氨基和Arg-124；另外，與半乳糖相比，乳糖與β-乳球蛋白的交聯位點具有專一性。

ESI-MS和MALDI-MS能夠精確測定美拉德產物的分子質量，分析美拉德產物交聯程度。例如，相關的MALDI-MS分析表明，β-乳球蛋白與半乳低聚糖發生美拉德反應(水分活度 0.44、40℃、反應23d)后，β-乳球蛋白的平均分子質量增加了21%[34]。French等[35]分別采用干熱法和濕熱法制備β-乳球蛋白-乳糖共聚物，然后利用ESI- MS和MALDI-MS測定反應過程中β-乳球蛋白的糖基化反應程度；他們發現，隨著反應時間的延長(＞3h)，濕熱法所得產物的ESI-MS圖譜中糖蛋白的信號消失，隨之非糖蛋白的信號強度增強；然而，當利用高靈敏度的MALDI-MS分析時，結果表明產物仍然是糖蛋白，其最大的交聯度為11%～12%。

紅外光譜在一定程度上能夠反應蛋白質的一級結構。糖基化蛋白一級結構的變化，主要體現在C－N和N－H鍵的變化，這些基團具有紅外特征吸收峰。Gu等[36]分析酪蛋白與葡萄糖的美拉德產物的紅外特征，結果表明，酰胺-Ⅰ和酰胺-Ⅱ吸收強度減少，相應的，C＝O(1650cm－1)和C－N(1540cm－1)的吸收強度增強；酰胺-Ⅲ(主要是C－N伸縮振動和N－H伸縮振動，在1300～1200cm－1有吸收)的吸收強度減小，這也一定程度上表明蛋白質一級結構發生了改變。

1.3.3 二級結構

整體上看，美拉德反應糖基化引起蛋白質二級結構的改變，主要表現為α螺旋、β折疊、β轉角和無規則卷曲的增減。相關研究采用的手段主要為圓二色譜和X射線等。

采用圓二色譜分析糖基化蛋白的二級結構的研究相對較多。Niu等[28]研究表明，小麥胚芽蛋白的二級結構中α螺旋57%、β折疊9%、無規則卷曲33%；而其與葡聚糖進行美拉德反應后，產物的二級結構中α螺旋99%、無規卷曲1%。這一分析結果表明糖基化反應對蛋白質的二級結構影響很大。Darewicz等[37]的研究表明，β-酪蛋白-葡萄糖的糖基化產物中β轉角結構增加，而無規卷曲結構減少，α螺旋和β-折疊結構沒有明顯變化。Stanic-Vucinic等[38]采用圓二色譜研究β乳球蛋白與一些單糖(如葡萄糖、半乳糖、果糖、核糖和阿拉伯糖)或二糖(乳糖)的美拉德反應產物，結果表明，蛋白質的二級結構和三級結構基本不變。β-乳球蛋白與葡萄糖反應后得到的共聚物，其二級和三級結構也基本不變[39]。羧甲基纖維素-大豆分離蛋白共聚物的X射線衍射掃描表明，美拉德反應會降低大豆分離蛋白的結晶度[40]。

1.4 美拉德反應糖基化途徑所存在的問題

蛋白質的美拉德反應糖基化修飾能夠有效地改善蛋白質的功能性質，但是所存在的問題也不容忽視。1)制備工藝上，美拉德糖基化存在不足。目前，糖基化反應途徑主要包括2種方法：干熱法和濕熱法。干熱反應速率很慢，在已研究的蛋白中，酪蛋白反應速率最快，要達到理想的反應程度需要大約 24h，而多數蛋白質在適宜的條件下的常常需要 2～3 周才能完成反應。同時，利用干熱反應、欲得到理想的糖基化產物，就需要對反應條件加以嚴格控制。濕熱法糖基化，雖然速度有所提高，但是主要是應用在簡單蛋白質與單糖或雙糖之間的反應，如β-乳球蛋白與乳糖的濕熱反應[35,39]。2)美拉德反應存在產品褐變而影響產品的感官特性的問題，這是所不期望的。3)存在降低食品蛋白質的營養價值的問題[41]。賴氨酸是必需氨基酸，而美拉德反應中，賴氨酸通常是首先反應的交聯位點。4)由于反應中所得的產物的結構極其復雜，種類繁多，因而存在食品安全問題[42]。有研究證實，一些含水量低且富含淀粉和糖類的物質，加熱處理后形成5-羥甲基糠醛，該物質的代謝產物是5-硫代甲氧基糠醛，它對細菌和哺乳動物細胞具有損傷基因及誘發突變的作用[43]。也有研究證實，美拉德終產物可以引起氧化性應激和毒害神經元[44-45]、引發炎癥[46]、促使結締組織老化[47]。

可見，利用美拉德反應對蛋白質進行糖基化修飾，確實存在一些不足之處。因此，需要尋求可以替代美拉德反應的蛋白質糖基化新方法，例如，利用某些酶的作用。

2 轉谷氨酰胺酶途徑

2.1 轉谷氨酰胺酶與其催化反應機制

轉谷氨酰胺酶(EC 2.3.2.13)廣泛地存在于動物、植物和微生物體內。商品化的轉谷氨酰胺酶最初是從豚鼠肝臟中提取的，由于酶的原料來源較少、分離純化工藝復雜，導致酶的價格十分昂貴，僅限于基礎研究中應用。因此早期關于轉谷氨酰胺酶應用的研究較少。1993年日本味素公司將微生物轉谷氨酰胺酶實現了工業化生產，推出的轉谷氨酰胺酶，推動了該酶在研究和生產中的應用。此后，關于轉谷氨酰胺酶改善蛋白質功能性質的研究相當多，應用于眾多類型的食品，如海洋食品、肉制品、乳制品、面制品、烘焙食品、豆制品等，相關文獻和綜述頗多，這里不加介紹。

圖 1 轉谷氨酰胺酶催化的蛋白質交聯與胺類化合物導入反應Fig.1 Cross-linking of proteins and incorporation of amine compounds catalyzed by transglutaminase

轉谷氨酰胺酶能夠催化蛋白質分子中谷氨酰胺殘基與賴氨酸殘基中的ε-氨基發生反應，形成分子內和/或分子間形成ε-(γ-谷氨酰基)賴氨酸異肽鍵，結果使蛋白質分子發生交聯。其中，賴氨酸殘基可以被伯胺類物質取代，即轉谷氨酰胺酶能夠催化蛋白分子中谷氨酰胺殘基與伯胺類物質發生反應。也就是說，對于蛋白質底物，轉谷氨酰胺酶可催化以下兩種反應，如圖1所示。反應A產生γ-谷氨酰基-ε-賴氨酸側鏈肽，導致蛋白質交聯；反應B使得在蛋白質底物上導入胺類化合物，兩種反應競爭發生[48]。如果所導入的胺類化合物是一個氨基糖，就產生蛋白質的糖基化反應。但利用轉谷氨酰胺酶對蛋白質進行糖基化的研究較少，同時，蛋白質分子之間的交聯反應也是不可避免的。

2.2 蛋白質轉谷氨酰胺酶途徑糖基化研究近況

相對于轉谷氨酰胺酶催化的蛋白質交聯的研究，轉谷胺酰胺酶途徑的蛋白質糖基化研究極少，僅有有限的幾篇報道。起初，研究者嘗試利用該酶改善生物酶的性質。Villalonga等[49]利用轉谷氨酰胺酶的催化作用使β-環糊精的衍生物(單-[6-(乙二胺)-6-脫氧]-β-環糊精等)與胰蛋白酶交聯，發現胰蛋白酶-環糊精共聚物的熱穩定性大大增強。Yan等[50]利用動物來源的轉谷氨酰胺酶，將胺化的麥芽三糖導入β-酪蛋白，1mol琥珀酰化的β-酪蛋白可結合8mol胺化的麥芽三糖，首先證實轉谷氨酰胺酶途徑實現蛋白質糖基化的可行性。隨后，Colas等[51]利用轉谷氨酰胺酶，將半乳糖胺導入豌豆蛋白和醇溶蛋白，每摩爾豌豆蛋白及醇溶蛋白分別導入18和57個糖基單位(6-乙氨基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖），糖基化蛋白在等電點處的溶解度增加了20%。隨后，利用轉谷氨酰胺酶對蛋白質糖基化的研究幾乎停滯。

最近，本研究組也注意到轉谷胺酰胺酶在蛋白質糖基化方面的潛力，分別將氨基葡萄糖共價交聯至大豆分離蛋白和酪蛋白，同時誘導蛋白質發生交聯反應，并發現糖基化蛋白質的溶解性、乳化性質等都有較大改善，尤其是流變學性質[52-54]。反應時間短、產物的性質變化顯著。與單糖相比，寡糖具有更高的分子質量和更多的親水性羥基，利用轉谷氨酰胺酶將寡糖導入蛋白質中，在改善蛋白質功能特性方面將會具有更好的前景。所以，Flanagan等[55]就利用轉谷氨酰胺酶將酪蛋白酸鈉與阿拉伯膠共聚，賦予產品新的功能性質。不過，有關糖基化反應對蛋白質結構的影響，結構變化與功能性質之間的內在關系，還未得到揭示和解釋。

轉谷氨酰胺酶催化的蛋白質糖基化，是一種有前景的糖基化途徑，能夠有效的改善蛋白質的功能性質，并且不存在美拉德反應途徑中所存在的那些副反應。需要進一步深入研究不同種類的蛋白質與具有伯胺特性的糖類之間的糖基化反應，以及糖基化反應對功能性質的影響，以最終建立轉谷氨酰胺酶途徑的蛋白質新型糖基化技術。

3 結 語

美拉德反應是一個食品蛋白質糖基化反應修飾時最重要的反應，在改善蛋白質的乳化性、溶解性、流變學性質等方面產生有利的影響，但是也存在反應速度慢的缺點，以及食品安全性、營養學上的不足。基于轉谷氨酰胺酶途徑的蛋白質糖基化，具有反應速度快、不產生副反應等優點，具有進一步研究、開發的前景。

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