Apelin-13對5-Aza誘導臍帶間充質干細胞向心肌細胞分化的影響

徐小紅，王力，張寧坤，鄭楠，高連如，朱智明

Apelin-13對5-Aza誘導臍帶間充質干細胞向心肌細胞分化的影響

徐小紅，王力，張寧坤，鄭楠，高連如，朱智明

目的探討apelin-13蛋白在體外對5-氮胞苷(5-Aza)誘導人臍帶間充質干細胞(hUC-MSCs)向心肌細胞分化的影響。方法采用組織塊貼壁法培養hUC-MSCs，胰酶消化傳代；取P2代細胞置于不同分化條件的培養液中分化培養14d，實驗分為A、B、C、D組(apelin-13濃度分別為0、1×10－6、2×10－6和10×10－6mol/L)，各組培養基中5-Aza濃度均為10×10－6mol/L。采用流式細胞儀檢測hUC-MSCs表面免疫標記，MTT法檢測細胞在570nm處的吸光度(A)值，RTPCR檢測肌鈣蛋白T(cTnT)、GATA-4 mRNA表達水平，免疫組織化學染色法檢測心肌細胞表面標志物cTnT的表達。結果流式細胞儀鑒定結果表明，hUC-MSCs表達CD44、CD90、CD105、CD73、經典人類白細胞抗原Ⅰ類抗原(HLAABC)，不表達CD34、CD45、經典人類白細胞抗原Ⅱ類抗原(HLA-DR)。MTT檢測顯示，0、10×10－6mol/L apelin-13處理的hUC-MSCs在570nm處的A值分別為0.841±0.290、0.875±0.325，差異無統計學意義(P＞0.05)。B、C、D組cTnT mRNA表達水平分別是A組的2.09±1.35、5.24±1.30、1.17±0.63倍，B、C、D組GATA-4 mRNA表達水平分別是A組的2.68±1.18、4.82±0.14、2.14±0.27倍；C組與B、D組比較，cTnT、GATA-4 mRNA表達差異具有統計學意義(P＜0.05)。免疫組化染色顯示，誘導14d后C組細胞cTnT蛋白表達呈陽性。結論10×10－6mol/L apelin-13對hUC-MSCs無毒性作用，一定濃度的apelin-13蛋白可增強5-Aza誘導hUC-MSCs向心肌細胞分化的效率，濃度為2×10－6mol/L時增強作用最明顯。

臍帶；間質干細胞；心肌；細胞分化；apelin-13；5-氮胞苷

目前，藥物、介入、外科搭橋手術均無法補充因心肌壞死丟失的心肌細胞，心肌梗死后缺血性心力衰竭的發病率正日益升高[1]。Wang等[2]采用apelin加含有bFGF、activin-A、BMP4的培養基誘導鼠和人胚胎干細胞向心肌細胞分化，證實apelin可以增強含bFGF、activin-A、BMP4的培養基誘導鼠和人胚胎干細胞向心肌細胞分化的能力。目前尚未見有關apelin蛋白在體外對5-氮胞苷(5-Aza)誘導hUCMSCs向心肌細胞分化影響的報道，本實驗通過觀察5-Aza聯合apelin-13誘導hUC-MSCs向心肌細胞分化的效率，探討apelin蛋白在hUC-MSCs向心肌細胞分化中的作用，以期建立更優的誘導hUC-MSCs向心肌細胞分化的方案。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑 所有標本均取自海軍總醫院產科當日剖宮產健康嬰兒的新鮮臍帶，長度約8cm。胎齡37～40周，均無先天性疾病；產婦體健，無肝炎、梅毒、艾滋病等傳染性疾病，產婦及家屬對臍帶用于實驗研究均知情同意。Trizol(Gibco公司)；5-Aza、MTT(Sigma公司)；apelin-13(Santa Cruz公司)；兔抗人肌鈣蛋白T(cTnT)抗體(工作濃度1:100，北京博奧森生物技術公司)；二抗為聚合HRP標記羊抗兔IgG(武漢博士德生物公司)；DAB試劑盒、即用型兔IgG兩步法免疫組化試劑盒(SV0002，武漢博士德生物公司)；Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus，大連寶生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 hUC-MSCs的分離、培養 無菌取剖宮產嬰兒的新鮮臍帶，以平衡鹽溶液洗去臍帶殘留血液，剪成3～4cm的小段，每段均沿靜脈腔剪開，平鋪后剔除靜脈，再深入剪開華通膠(血管之間、血管與外膜之間的膠狀物)，剔除2根動脈，取華通膠并剪切成1mm3及以下小塊，接種于T75培養瓶內，細胞貼壁約90%融合后傳代培養。

1.2.2 hUC-MSCs的鑒定 流式細胞儀檢測細胞表面標志物：取擴增傳代2代的臍帶華通膠間充質干細胞，棄培養基，PBS洗2遍，用0.25%胰蛋白酶消化，血清終止消化，用PBS洗滌、重懸，調整細胞密度為1×106/ml，取1ml/管，共8管，分別加入鼠抗人單克隆抗體PE-CD90、PE-CD105、PE-CD44、PE-CD73、PE-HLA-ABC、FITC-CD45、FITCCD34、FITC-HLA-DR各20μl，充分混勻，避光室溫孵育30min，PBS洗2遍，250×g離心10min，重新制成細胞懸液0.5ml，流式細胞儀檢測。

1.2.3 MTT法檢測細胞增殖情況 常規胰酶消化P2代細胞，得到細胞懸液，1000r/min離心5min，棄上清，加新鮮培養基制成懸液，計數，調整細胞密度為1×105/ml，按2×104/孔接種于96孔板，加新鮮培養基培養24h。24h后棄舊培養基，實驗分為對照組(單純基礎培養基)和實驗組(含有10×10－6mol/L apelin-13的培養基處理細胞24h)，每組設5個復孔。繼續置于37℃、5%CO2培養箱培養24h。24h后棄培養基，換新鮮培養基，各孔加10μl MTT(5mg/L)，4h后吸棄，加二甲基亞砜，在搖床上低速搖10min，用酶標儀檢測兩組細胞在570nm處的吸光度(A)值。

1.2.4 hUC-MSCs向心肌細胞的誘導分化 常規0.25%胰酶消化P2代細胞，血清終止消化，PBS洗滌、重懸，調整細胞密度為5×106/ml，接種于T25瓶，實驗分為A、B、C、D 4組(apelin-13濃度分別為0、1×10－6、2×10－6和10×10－6mol/L)，置于37℃、5%CO2培養箱中培養，待細胞約80%融合后向各組培養基中加入終濃度為10×10－6mol/L的5-Aza。繼續置于37℃、5%CO2培養箱中培養24h。24h后棄培養基，繼續換用新鮮培養基培養，以后每隔2～3d換液1次，B、C、D組每天分別加入1×10－6、2×10－6和10×10－6mol/L apelin-13。分別于誘導后1、7、10、14d在倒置顯微鏡下觀察細胞形態及生長情況。

1.2.5 RT-PCR檢測心肌細胞表面標志物mRNA表達 收集上述各組誘導14d后的細胞，按Trizol試劑盒說明書提取總RNA。取適量RNA進行反轉錄反應，以cDNA為模板，引物序列如下：cTnT，正義5'-ACAGAGCGGAAAAGTGGGAAG-3'，反義5'-TCGTTGATCCTGTTTCGGAGA-3'，產物大小230bp；GATA-4，正義5'- CGACACCCCAATCTCGA TATG-3'，反義5'-GTTGCACAGATAGTGACCCGT-3'，產物大小117bp；內參照GAPDH，正義5'-GACATG CCGCCTGGAGAAAC-3'，反義5'-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3'，產物大小1166bp。使用Bio-Rad RCR儀進行擴增反應，總反應體系25μl。擴增條件：95℃ 30s；95℃ 5s、60℃ 60s，共40個循環。目的基因與內參照基因同時檢測，每個樣本設置3個復孔，比較各組間的差異，實驗重復3次。

1.2.6 免疫組織化學染色檢測心肌細胞表面標志物CTnT的表達 實驗組(2×10－6mol/L apelin-13+10×10－6mol/L 5-Aza)細胞在T25瓶分化培養至11d時，以0.25%胰酶消化細胞，離心棄上清；加新鮮培養基制成懸液，調整細胞密度為5×104/ ml，接種于預置蓋玻片的24孔板內。待細胞在蓋玻片貼壁生長，融合達80%時，吸棄培養液。采用SP法行免疫組化檢測cTnT的表達，按說明書操作，用PBS代替一抗作為陰性對照。DAB顯色，高倍鏡觀察結果。對照組不加apelin-13和5-Aza，其余處理同實驗組。

1.3 統計學處理 應用SPSS 18.0軟件進行統計分析。數據以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗；實驗組與空白對照組的比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 hUC-MSCs分離、傳代培養結果 臍帶華通膠組織塊接種于完全培養基培養10d后，顯微鏡下可見在組織塊周圍有黏附培養瓶壁生長、成纖維細胞樣、有偽足伸出、有折光性的細胞，15、16d后細胞融合(圖1A)；按1×106個/75cm2培養瓶傳代培養，3～5d后細胞即融合(圖1B)。

圖1 倒置顯微鏡下的hUC-MSCs形態(×40)Fig.1 Morphology of hUC-MSCs under inverted microscope (×40)

2.2 臍帶間充質干細胞表面抗原分子表達 流式細胞儀檢測顯示，P2代hUC-MSCs高表達間充質干細胞抗原CD44、CD90、CD105、CD73，HLAABC，而不表達造血干細胞抗原CD45、CD34和白細胞相關抗原HLA-DR(圖2)。

圖2 hUC-MSCs表面標記物的流式細胞儀檢測結果Fig.2 hUC-MSCs surface markers detected by flow cytometry

2.3 細胞增殖能力 MTT法檢測顯示：10×10－6mol/L的apelin-13可促進hUC-MSCs增殖，但與對照組相比差異無統計學意義(0.875±0.325vs0.841±0.290，P＞0.05)。

2.4 心肌細胞表面標志物cTnT、GATA-4 mRNA的表達 B、C、D組cTnT mRNA的表達水平分別是A組的2.09±1.35、5.24±1.30、1.17±0.63倍，C組與B、D組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，而B組與D組間差異無統計學意義(P＞0.05)。B、C、D組GATA-4 mRNA的表達水平分別是A組的2.68±1.18、4.82±0.14、2.14±0.27倍，C組與B、D組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，而B組與D組的表達差異無統計學意義(P＞0.05，圖3)。

圖3 心肌細胞表面標志物cTnT、GATA-4的mRNA表達Fig.3 mRNA expression of myocardial cell surface markers, cTnT and GATA-4

2.5 cTnT蛋白免疫組化檢測結果 cTnT蛋白在實驗組細胞有著色，著色位于細胞質，而對照組細胞未著色(圖4)。

圖4 cTnT蛋白表達的免疫組化檢測結果(×200)Fig.4 Expression of cTnT protein detected by immunohistochemisty (×200)

3 討 論

Apelin是孤兒G蛋白耦聯受體血管緊張素受體1(AT1)相關受體的內源性配體，由Tatemoto等[3]于1998年從牛胃組織提取物中提取并純化，近年研究發現apelin/APJ信號通路在心血管定向分化中具有極其重要的地位。Gao等[4]研究發現，骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem，BMSCs)向心肌細胞分化中有APJ受體及其配體apelin表達，且隨著BMSCs向心肌細胞的分化，APJ和apelin mRNA呈現出動態高表達。Gao等[5]進一步研究發現hUC-MSCs與胚胎干細胞表達類似水平的APJ及apelin mRNA。Apelin前體肽(preproApelin)含有77個氨基酸，其C末端為特異結合APJ受體的部位，富含堿性氨基酸殘基，也是翻譯后加工酶修飾剪切的部位，可被肽酶分解成多種相對分子量不同的成熟apelin活性肽，如apelin-36、apelin-17、apelin-13、apelin-12等[6]。近年來研究發現，apelin/APJ與胚胎心肌分化有關，外源性給予apelin mRNA可嚴重影響斑馬魚心肌的分化，表現為CMLC2、Nkx2.5表達下降[7]。Zeng等[8]研究也發現，apelin過表達會造成原腸胚受損，心肌細胞特異分化破壞，如局部apelin缺乏，則心臟前體細胞不能到達特定的生心區，即胚胎前側中胚葉區域，進而影響心臟發育。Wang等[2]在蛋白水平證實了0.5mmol/L apelin-13可以增強bFGF、activin-A、BMP4誘導人胚胎干細胞向心肌細胞分化的能力。

cTnT是心肌細胞特異性的表面標志物，GATA-4是心臟形成過程中必需的劑量依賴性轉錄因子，參與調節心肌細胞結構基因和相關調控基因的表達，還可與多種心肌基因調控區域結合，參與心肌細胞的分化過程。在心臟發育早期抑制GATA-4的表達將抑制前心肌細胞及分化終末期心肌細胞的發育，阻斷原始肌管的形成。相反，增加GATA-4表達將加速心臟的發育，并明顯增加分化末期搏動的心肌細胞數量[9]。本實驗中，誘導分化14d后，實驗組細胞GATA-4 mRNA的表達較對照組明顯增高，但不足之處在于未動態監測多個時間點GATA-4 mRNA的表達水平。

目前，5-Aza作為一種促使間充質干細胞向心肌細胞分化的誘導劑已得到確認，本研究通過5-Aza聯合使用不同濃度apelin-13誘導hUC-MSCs向心肌細胞分化，采用RT-PCR及免疫組化方法檢測心肌細胞表面標志物cTnT和心肌早期轉錄因子GATA-4的表達，結果提示hUC-MSCs細胞均已向心肌定向分化，并表達心肌特異性蛋白cTnT。加入不同濃度apelin-13后cTnT、GATA-4 mRNA的表達均明顯高于對照組。Zeng等[8]研究結果提示，apelin mRNA過表達和缺乏均影響心臟發育，表明合適濃度的apelin才會促進心臟前體細胞到達生心區促進心臟發育。本研究結果顯示，3個不同apelin-13濃度組中，2×10－6mol/L apelin-13促進5-Aza誘導hUC-MSCs向心肌細胞分化的能力最強，與Zeng等的觀點一致。Wang等[2]在實驗中發現，0.1×10－6、0.5×10－6mol/L的apelin-13分別是促進鼠、人胚胎干細胞向心肌分化的最合適濃度，與本實驗的最優濃度2×10－6mol/L有差別，說明不同的細胞以及不同的培養體系中apelin-13的最優濃度存在差異，這可能與apelin影響心肌分化的機制有關。首先apelin作為趨化因子，可招募和增強心臟中胚層祖細胞聚集，Scott等[7]研究表明，過多或過少的apelin表達都會擾亂內源性趨化因子梯度，進而導致心臟祖細胞遷移失敗。其次，apelin/APJ可能是以自分泌的形式參與心肌形成的[3-4]。Ashley等[10]發現小鼠胚胎心肌中有apelin/APJ mRNA和蛋白表達，且其表達貫穿心臟發育的全過程，而在成體小鼠心肌中只有APJ的表達，提示不同來源的間充質干細胞可能自分泌不同量的apelin參與心肌形成。D'Aniello等[11]的研究提示apelin/APJ信號通路作為Cripto/Smad2下游的效應因子，通過激活細胞外調控激酶(ERK)調控心肌細胞特異分化。但是目前apelin影響心肌細胞分化的具體機制仍未闡明。

為探討較高濃度的apelin-13對hUC-MSCs是否有毒性作用，本研究采用10×10－6mol/L apelin-13處理細胞24h，并用MTT法檢測細胞在570nm處的A值，結果表明該濃度的apelin-13對細胞無毒性作用，為此后用2×10－6mol/L的apelin-13聯合5-Aza誘導hUC-MSCs向心肌細胞分化提供了實驗依據。

綜上所述，10×10－6mol/L apelin-13對hUCMSCs無明顯毒性作用，一定濃度的apelin-13蛋白可促進5-Aza誘導華通膠間充質干細胞向心肌細胞的分化，濃度為2×10－6mol/L時促進作用最明顯。

再生醫學可從根本上改善缺血性心臟病的預后，而心臟再生醫學不僅需要尋求誘導干細胞向心肌細胞定向分化的關鍵因子，還需要選擇具有臨床應用前景的種子細胞。hUC-MSCs是一種明顯較骨髓間充質干細胞更原始、增殖分化潛能更強、介于成體與胚胎干細胞之間的原始干細胞，且其能分泌表達APJ及apelin mRNA。因此，進一步研究apelin對hUC-MSCs向心肌細胞分化的影響及其機制，具有重要臨床意義。

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Influence of apelin-13 on 5-azacytidine inducing differentiation of umbilical cord mesenchymal stem cells to cardiomyocytes

XU Xiao-hong1, WANG Li2, ZHANG Ning-kun2, ZHENG Nan2, GAO Liao-ru2, ZHU Zhi-ming2*
1Affiliated Clinical Faculty of Navy General Hospital, Anhui Medical University, Beijing 100048, China
2Department of Cardiology, Navy General Hospital, Beijing 100048, China
*

, E-mail: xujilong18@126.com
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81170094)

ObjectiveTo explore the influence of apelin-13 on 5-azacytidine (5-Aza) inducing differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUC-MSCs) to cardiomyocytes. MethodshUC-MSCs were cultivated by tissue adherent method, and subcultured after digested with trypsin. The second passage cells (P2) were cultured for 14 days with different concentrations of apelin-13 (0, 1×10–6mol/L, 2×10–6and 10×10–6mol/L apelin-13, called as group A, B, C and D respectively), and the concentration of 5-Aza was 10×10–6mol/L in each group. Immune markers on the surface of hUC-MSCs were detected by flow cytometry, the absorbance (Avalue) of cultured cells at 570nm was detected by MTT method, the mRNA expression levels of troponin T (cTnT) and GATA-4 were determined by RT-PCR, and the expression of cTnT (myocardial cell surface marker) was observed by immunohistochemistry.ResultsHUC-MSCs expressed CD44, CD90, CD105, CD73 and HLA-ABC, but did not express CD34, CD45 or HLA-DR. TheAvalue at 570nm of hUC-MSCs treated with 10×10–6mol/L apelin-13 was 0.875±0.325 and similar to that of hUC-MSCs treated with 0 mol/L apelin-13 (0.841±0.290,P＞0.05). The expression levels of cTnT mRNA and GATA-4 mRNA in groups B, C and D were 2.09±1.35, 5.24±1.30 and 1.17±0.63 and 2.68±1.18, 4.82±0.14 and 2.14±0.27times those in group A. The expression levels of cTnT and GATA-4 mRNA in group C were significantly higher than those in groups B and D (P＜0.05). Immunohistochemical staining showed cTnT protein was positively expressed in group C after induction for 14 days.ConclusionsThere is no toxic effects of apelin-13 at concentration of 10×10–6mol/L on hUC-MSCs. Certain concentrations of apelin-13 could promote the 5-Aza inducing differentiation of hUC-MSCs to cardiomyocytes, especially at 2×10–6mol/L.

umbilical cord; mesenchymal stem cells; myocardium; cell differentiation; apelin-13; 5-azacytidine

R542.22

A

0577-7402(2013)10-0796-05

10.11855/j.issn.0577-7402.2013.10.003

2013-05-17；

2013-06-24)

(責任編輯：張小利)

國家自然科學基金(81170094)

徐小紅，碩士研究生。主要從事干細胞的基礎與臨床研究

100048 北京 安徽醫科大學解放軍海軍臨床學院(徐小紅)；100048 北京 海軍總醫院心臟中心(王力、張寧坤、鄭楠、高連如、朱智明)

朱智明，E-mail：xujilong@126.com