應用基因芯片技術篩選與電離輻射劑量相關的血清細胞因子

劉瓊，何穎，沈先榮，莫琳芳，王慶蓉，陳偉，蔣定文，侯登勇，何曉義，錢甜甜，劉玉明，李珂嫻

應用基因芯片技術篩選與電離輻射劑量相關的血清細胞因子

劉瓊，何穎，沈先榮，莫琳芳，王慶蓉，陳偉，蔣定文，侯登勇，何曉義，錢甜甜，劉玉明，李珂嫻

目的利用基因芯片技術初步篩選對電離輻射劑量敏感的血清細胞因子并分析其變化規律。方法健康雄性C57BL/6小鼠80只，隨機分為對照組(n=20)和輻射組(n=60)。輻射組大鼠分別接受劑量為3、5、10Gy的60Co一次性照射，每個劑量組20只。照射后6h經眼球取血，留存血清。采用基因芯片技術檢測血清細胞因子基因的表達水平，篩選出有變化的細胞因子，分析其變化規律。結果共篩選96種細胞因子。當輻射劑量為3Gy時，有44種細胞因子表達發生變化，當輻射劑量為5Gy和10Gy時，分別有47種和66種細胞因子表達發生變化。進一步分析發現，有14種因子表達呈劑量-效應依賴，其中7種隨劑量上升表達增加，7種隨劑量上升表達下調。結論通過基因芯片技術篩選的輻射敏感的細胞因子，其隨輻射劑量的變化存在一定規律，這種規律對估算電離輻射劑量有一定意義。

輻射，電離；細胞因子類；輻射劑量

電離輻射能誘導機體產生一系列生物反應[1-2]，炎癥因子在這一復雜的反應網絡中起著重要作用。目前已知的在電離輻射之后發生變化的細胞因子數量有限，而基因芯片是同時檢測大量標本的有利工具。本研究利用基因芯片技術，初步篩選對電離輻射劑量敏感的血清細胞因子，為進一步篩選可用于電離輻射劑量估算的細胞因子指標奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 雄性C57BL/6純系小鼠，7周齡，體重20±1g，購于蘇州工業園區愛爾麥科技有限公司(動物質量合格證號2013897)，飼養于SPF級動物房[動物飼養許可證號SCXK(蘇2009-000)]。80只小鼠隨機分為對照組(n=20)和輻射組(n=60)。輻射組小鼠分別接受3、5、10Gy一次性全身照射，每個劑量組20只，劑量率0.78Gy/min。輻射在第二軍醫大學60Co源室進行。

1.2 血清樣本采集 小鼠在輻射后6h經眼球取血，全血于室溫放置1h后，以2500r/min離心，小心吸取上層血清，以50μl/管分裝，凍存于－80℃。

1.3 基因芯片細胞因子檢測 輻射組小鼠每個輻射劑量取300μl混合血清用于基因芯片檢測(15μl/只)，樣品量為100μl/次，檢測3次，取平均值。細胞因子抗體芯片采用RayBio? Mouse Cytokine Antibody Array C Series 1000(RayBiotech，Inc.，AAMCYT-1000-4)。檢測采用雙抗體夾心法，通過熒光強度掃描讀取數據。

1.4 數據處理 芯片檢測數據原始值通過減去遠離陽性對照POS的空白對照值做修正，并用陽性對照POS做標準化，計算出標準化值。輻射組標準化值再與對照組比對，得出相應比值，若比值＞1.3或＜0.77，視為表達上調或下調。

2 結 果

2.1 輻射劑量敏感細胞因子篩查 共檢測了96種細胞因子。由表1可以看出，當輻射劑量升高時，變化的細胞因子數量增多：當輻射劑量為3Gy時，有34個因子上調，10個因子下調；當輻射劑量為5Gy時，有28個因子上調，19個因子下調；當輻射劑量為10Gy時，有40個因子上調，26個因子下調。其中，與對照組比較，3個劑量輻射均引起表達升高的有：受體酪氨酸激酶(AXL)、B淋巴細胞趨化因子(BLC)、Fas配體(Fas-ligant)、趨化因子Fractalkine、粒-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、細胞集落刺激因子(G-CSF)、干擾素γ(IFNγ)、細胞間黏附因子(ICAM-1)、白細胞介素7(IL-7)、白介素-17B受體(IL-17BR)、基質金屬蛋白酶-3(MMP-3)、骨保護素(osteoporotegerin)、蛋白-基質金屬蛋白酶-9(pro-MMP-9)、腫瘤壞死因子相關激活誘導因子(TRANCE)、金屬蛋白酶組織抑制劑-2(TIMP-2)、血管內皮細胞生長因子受體3(VEGFR3)。3個劑量均引起表達降低的有：CD40、胸腺表達化學因子(TECK)。此外，還有只對低劑量敏感的細胞因子，如細胞因子反應基因(CRG-2)、趨化因子16(CXCL16)和Ⅱ型可溶性腫瘤壞死因子α受體(sTNFRⅡ)。同樣，也存在只對高劑量敏感的細胞因子。當累積劑量≥5Gy時，變化的細胞因子有：CD30T、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、單核細胞趨化蛋白-5(MCP-5)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)和胸腺活化調節趨化因子(TARC)、金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP-1)。當累積劑量為10Gy時，變化的細胞因子有：胰島素樣生長因子結合蛋白-5(insulin-like growth factor binding protein，IGFBP-5)、發育受體酪氨酸激酶(Dtk)、Flt-3配體(Flt-3-ligand)、糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子(GITR)、重組人胰島素樣生長因子-Ⅱ(IGF-Ⅱ)、干擾素誘導的T細胞趨化因子(I-TAC)、瘦素(leptin)、淋巴細胞趨化因子(lymphotactin)、巨噬細胞源趨化因子(MDC)、MIG、巨噬細胞炎癥因子-1α(MIP-1α)、嗜中性粒細胞誘導因子(KC)、干細胞因子(SCF)、脂肪細胞因子(resistin)、胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)、血管內皮生長因子(VEGF)。

2.2 劑量-效應依賴細胞因子篩查 對輻射敏感的細胞因子進一步分析表明，有14種細胞因子表達呈劑量-效應依賴，其中7種細胞因子隨輻射劑量上升表達上調，7種細胞因子隨輻射劑量升高表達下調(圖1)。提示細胞因子表達量雖然受多方面調控，但輻射所致量效關系仍然存在。

表1 電離輻射劑量敏感細胞因子Tab.1 Cytokines sensitive to ionizing radiation dose

圖1 輻射劑量-效應依賴細胞因子Fig.1 Ionizing radiation dose-effectiveness-dependent cytokines

3 討 論

電離輻射導致的機體損傷由大量的分子事件組成，在這一復雜的反應網絡中，細胞因子起著重要作用。一方面，電離輻射引起的細胞損傷會導致其分泌的細胞因子異常，另一方面，細胞因子的異常分泌又會導致細胞事件的改變，不同的細胞因子與不同的細胞相互作用，就構成了復雜的反應網絡。同時，電離輻射劑量也與反應網絡的復雜性相關。有研究表明，血清蛋白質及其量的改變與電離輻射劑量相關[3-6]。同樣，本研究發現，發生變化的細胞因子種類隨輻射劑量增加而增多，當輻射劑量為3Gy時，有44種因子發生變化，當輻射劑量為5Gy時，有47種因子發生變化，而當輻射劑量為10Gy時，有66種因子發生變化。所以，電離輻射劑量與細胞因子變化的數量密切相關。

當然，電離輻射誘導的細胞因子變化是有規律可循的。有研究指出，在10Gy輻射情況下，大腦中TNF-α和TGF-β1在12h內呈現持續下降，而12h后，又逐漸升高；而IL-1在輻照后8h出現上升峰值，隨即含量下降，這能很好地反映大腦的急性損傷過程[7]；Singh等[8]報道了小鼠全身輻射后4、24h時細胞因子的變化情況，發現脾臟中G-CSF、GMCSF、IFN-γ、TPO、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10和IL-12升高，骨髓中GM-CSF、IFN-γ、TPO、IL-3和IL-10升高。本研究發現，包括AXL在內的16種因子在不同劑量電離輻射作用后表達均升高，CD40、TNF-α和TECK在不同劑量電離輻射作用后表達均下降。進一步研究還發現，有14種細胞因子的表達呈劑量-效應依賴，其中7種細胞因子隨劑量上升表達增高，7種細胞因子隨劑量升高表達下調。

細胞因子的規律性變化常常用于輻射后機體或臟器損傷的評估，例如TGF-β1、IL-6、KL-6、表面活性蛋白和IL-1α可很好地預測肺部化療患者肺急性損傷的程度[9-11]。當然，每個組織內細胞因子的變化不僅是預測損傷的重要依據，同時，它們隨輻射劑量而改變的特性也可作為判斷輻射劑量的重要依據。從總體來看，細胞因子變化數量越多，輻射劑量越大。同時，本研究通過抗體芯片篩查還發現，細胞因子的變化規律各不相同。其中，有僅對高劑量(10Gy)敏感的，也有僅對低劑量(3Gy)敏感的，利用這些特異的細胞因子變化規律可以初步區分輻射累積劑量的高低。當然，也存在對所有劑量都敏感，其變化存在劑量-效應關系的細胞因子，充分利用其劑量依賴的變化規律，能進一步確定受照劑量。

總之，本研究利用基因芯片技術篩查和分析了不同電離輻射劑量導致的血清中細胞因子的變化及其規律，進一步研究和驗證這些細胞因子的變化規律，不僅有利于評估電離輻射的損傷程度，還有利于估算電離輻射的劑量。

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Screening of cytokines associated with ionizing radiation dose in serum by cytokine array

LIU Qiong, HE Ying, SHEN Xian-rong*, MO Lin-fang, WANG Qing-rong, CHEN Wei, JIANG Ding-wen, HOU Dengyong, HE Xiao-yi, QIAN Tian-tian, LIU Yu-ming, LI Ke-xian
Radiation Effect and Protection Laboratory, Naval Medical Research Institute, Shanghai 200433, China
*

, E-mail: xianrong_sh@yahoo.com
This work was supported by the Grants from Medical Guide Project of Shanghai Municipal Science and Technology Commission (10411969300), the “Eleventh Five-Year” Tackle Key Problems in Science Technology of General Logistics Department of PLA (08G037), the Science Technology Program of the General Logistics Department of PLA (AHJ09J012), and the Shanghai Municipal Health Bureau Scientific Research Fund Project (20124435)

ObjectiveTo identify the cytokine biomarker candidates in serum associated with ionizing radiation dose, and analyze the patterns of them by cytokine antibody array.MethodsEighty male C57BL/6 mice were randomly divided into radiation group (n=60) and control group (n=20). Mice in radiation group were treated with60Co total-body irradiation with the dose of 3, 5 and 10Gy, respectively (20 each dose group). Six hours after radiation, blood was obtained from the orbital sinus bleeding, and serums were collected. The serum cytokine concentration was analyzed by antibody array of 96 mouse cytokines, and cytokine biomarker candidates which were shown to be dose-responsive to ionizing radiation had been identified. ResultsInterestingly, the majority of the 96 mouse cytokines showed positive changes in amounts of cytokine. Following ionizing radiation exposure, only 44 cytokines changed at the expose dose of 3Gy, while 47 cytokines changed at the dose of 5Gy and 66 cytokines at the dose of 10Gy. Further analysis revealed that 14 cytokines were shown to be dose-responsive to ionizing radiation. Among those, 7 cytokines were shown up-regulated in a dose-dependent trend in response to ionizing radiation, and 7 cytokines were shown downregulated.ConclusionThese serum cytokine biomarkers which are sensitive to ionizing radiation may act in a dose-dependent manner, suggesting that the serum cytokine biomarker candidates can be used for estimating dose of ionizing radiation.

radiation, ionizing; cytokines; radiation dosage

R144.1

A

0577-7402(2013)10-0822-04

10.11855/j.issn.0577-7402.2013.10.008

2013-05-29；

2013-08-13)

(責任編輯：李恩江)

上海市科學技術委員會醫學引導類科研項目(10411969300)；總后“十一五”科技攻關項目(08G037)；總后科研項目(AHJ09J012)；上海市衛生局項目(20124435)

劉瓊，理學博士，助理研究員。主要從事輻射防護方面的研究

200433 上海 海軍醫學研究所防護醫學研究室(劉瓊、何穎、沈先榮、莫琳芳、王慶蓉、陳偉、蔣定文、侯登勇、何曉義、錢甜甜、劉玉明、李珂嫻)

沈先榮，E-mail: xianrong_sh@yahoo.com