骨髓間充質干細胞移植對肺動脈高壓模型大鼠的作用

趙科研，王輝山，侯明曉，柳克祥，吳慧穎，李博

骨髓間充質干細胞移植對肺動脈高壓模型大鼠的作用

趙科研，王輝山，侯明曉，柳克祥，吳慧穎，李博

目的觀察骨髓間充質干細胞(MSCs)移植對野百合堿(MCT)誘導的肺動脈高壓模型大鼠的治療作用。方法采用全骨髓貼壁法培養Wistar大鼠MSCs，取第3～5代細胞進行移植。健康雄性Wistar大鼠40只，隨機分為對照組、MCT組、MCT/MSCs 5×105組和MCT/MSCs 1×106組，每組10只。MCT經腹腔注射(60mg/kg)，MSCs經頸外靜脈注射移植。4周后，測定大鼠右心室收縮壓(RVSP)后處死大鼠，取心臟組織稱取濕重計算心室比(即右心室與左心室＋室間隔的質量比)；取肺組織行HE染色、地衣紅染色和平滑肌actin免疫組化染色觀察。結果MSCs頸外靜脈移植4周后，MCT/MSCs 1×106組RVSP為35.6±8.4mmHg，心室比為0.357±0.092，均明顯低于MCT組(分別為47.2±10.5mmHg、0.445±0.094，P＜0.05)，而MCT/MSCs 5×105組的RVSP和心室比分別為42.5±11.3mmHg、0.400±0.073，與MCT組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。肺組織病理染色可見MCT/MSCs 1×106組肺小動脈中膜厚度(19.2%±3.8%)明顯低于MCT組(26.4%±4.9%，P＜0.05)，而MCT/MSCs 5×105組(23.3%±3.6%)與MCT組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。結論MSCs頸外靜脈移植對MCT誘導的肺動脈高壓具有治療作用，單次移植細胞數量達1×106個可獲得較好的治療效果。

間質干細胞移植；野百合堿；高血壓，肺性

肺動脈高壓(pulmonary artery hypertension，PAH)是常見的心血管疾病，主要特征為肺動脈壓力和肺血管阻力進行性升高，最終導致患者右心衰竭而死亡，其病因復雜，診斷及治療較為困難。雖然目前一些藥物可暫時降低肺動脈壓力，改善PAH患者的運動耐力和生活質量，但其效果無法持久。有學者嘗試采用內皮祖細胞、內皮樣祖細胞和基質干細胞等移植，以再生健康的內皮細胞治療PAH，獲得了初步療效[1-2]。野百合堿(monocrotaline，MCT)是豆科植物野百合中提取的生物堿，具有細胞毒性作用，其代謝產物通過肺臟時沉積于肺小動脈壁及肺毛細血管，導致肺血管損傷，破壞肺組織內皮細胞等，最終形成PAH，故常用于制作PAH動物模型[3-5]。本研究采用MCT建立PAH動物模型，觀察了骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)靜脈移植對PAH的治療作用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性Wistar大鼠，3周齡，體重60～70g，成年雄性Wistar大鼠40只，體重180～250g，均由吉林大學實驗動物中心提供。

1.2 主要儀器及試劑 全自動顯微鏡數碼攝像系統(Olympus，日本)，多功能病理圖像分析儀(同濟)，BL-420E＋生物機能實驗系統(成都泰盟科技有限公司)，流式細胞儀(Becton Dickinson，美國)。低糖DMEM培養基、特級胎牛血清(Gibco公司)，胰酶(Sigma公司，美國)，亞美尼亞倉鼠抗大鼠CD29-Alexa Fluor、小鼠抗大鼠CD45-FITC(Biolegend公司，美國)，小鼠抗大鼠CD44-PE、小鼠抗大鼠CD34-FITC(Santa Cruz公司，美國)，平滑肌actin免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 MSCs的分離、培養和鑒定 清潔級雄性Wistar大鼠幼鼠斷頸處死，乙醇浸泡15min，無菌條件下分離股骨、脛骨，DMEM培養液沖洗骨髓腔；洗滌后的沉淀以含10%胎牛血清的DMEM混懸，接種于100ml培養瓶中，5%CO2、37℃下培養，24～48h后換液，每2～3d更換一次培養基，相差顯微鏡下觀察，待細胞80%融合后以0.25%胰酶消化，計數并傳代。收獲第3代細胞，CD29-Alexa Fluor、CD34-FITC、CD44-PE、CD45-FITC鑒定，流式細胞儀檢測。取3～5代MSCs以含EDTA的0.25%胰酶消化，PBS沖洗，PBS懸浮細胞(1000個/μl)，置于冰上直至移植開始。

1.2.2 動物分組 40只成年雄性Wistar大鼠隨機分為4組(n=10)：對照組、MCT組、MCT/MSCs 5×105組、MCT/MSCs 1×106組，后三組大鼠經腹腔注射MCT 60mg/kg，對照組注入等量鹽水。全麻后固定，頸部正中切口切開并游離右側頸外靜脈，1ml注射器給予MSCs(MCT組和對照組給予等量PBS)，4周后進行測壓、取材。

1.2.3 大鼠右心室收縮壓(right ventricular systolic pressure，RVSP)測量 移植后4周，暴露大鼠右頸外靜脈1cm，采用3F嬰幼兒穿刺鞘管(美國Cook公司)由頸外靜脈經前腔靜脈、右心房緩慢推入右心室，根據壓力波形觀察測定RVSP。

1.2.4 大鼠心室比測定 測量RVSP后處死大鼠，取出心臟，沿房室溝剪除心房組織，沿室間隔右心室邊緣分離右心室，用濾紙吸去血液，稱濕重，計算心室比，即右心室與左心室＋室間隔的質量比，并以此作為衡量右心室肥大的指標。

1.2.5 大鼠肺組織形態學觀察 大鼠處死后由主支氣管灌注中性甲醛固定緩沖液，使肺組織膨脹固定20min，然后切下肺組織浸泡于中性甲醛溶液中，48h后取材制作石蠟切片，厚約5μm，每個肺組織標本取5支肺泡水平肺小動脈，行HE染色、平滑肌actin免疫組化染色和彈力纖維地衣紅染色。彈力纖維染色圖片采用200倍光鏡觀察，采集圖像后分別測定內、外彈力板的平均直徑，根據公式計算中膜厚度百分比(WT%)[6]。WT%=(2×WT/ED)×100%。其中WT為中膜厚度，ED為血管外徑。

1.3 統計學處理 采用SPSS 16.0軟件進行統計分析。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 MSCs培養及鑒定結果 骨髓細胞接種于培養瓶后6～8h可見間充質干細胞貼壁，呈圓形或多角形；2～3d后可見細胞呈短梭形、短棒狀或星形；6～7d見細胞呈集落狀生長，放射狀排列；約14d細胞幾乎長滿培養皿底，呈魚群、旋渦狀分布。傳代后的細胞生長迅速，多為梭形，貼壁快，24h便可全部貼壁、伸展，呈均勻分布、增殖；3～4d可見細胞融合生長為單層。第3代MSCs表面標記物CD29、CD44、CD34和CD45的陽性率分別為98.6%、78.2%、0.0%、0.3%。

2.2 移植后RVSP及心室比的改變 移植后4周，與對照組比較，其余3組RVSP及心室比均明顯增加(P＜0.05)。與MCT組比較，MCT/MSCs 1×106組RVSP及心室比均明顯下降(P＜0.05)，而MCT/MSCs 5×105組RVSP及心室比下降不明顯(P＞0.05，表1)。

表1 移植后4周各組大鼠RVSP、心室比及肺小動脈中層厚度變化±s，n=10)Tab. 1 Changes of RVSP, ventricular ratio and media thickness of pulmonary artery 4 weeks after transplantation±s,n=10)

表1 移植后4周各組大鼠RVSP、心室比及肺小動脈中層厚度變化±s，n=10)Tab. 1 Changes of RVSP, ventricular ratio and media thickness of pulmonary artery 4 weeks after transplantation±s,n=10)

RVSP. Right ventricular systolic pressure; Ventricular ratio. Mass ratio of right ventricle to left ventricle and ventricular septum; MTPA. Media thickness of the pulmonary arterioles. (1)P＜0.05 compared with control group; (2)P＜0.05 compared with MCT group

GroupRVSP(mmHg)Ventricular ratioMTPA(%) Control25.2±4.00.235±0.02110.1±1.1 MCT47.2±10.5(1)0.445±0.094(1)26.4±4.9(1)MCT/MSCs 5×10542.5±11.3(1)0.400±0.073(1)23.3±3.6(1)MCT/MSCs 1×10635.6±8.4(1)(2)0.357±0.092(1)(2)19.2±3.8(1)(2)

2.3 移植后肺組織病理學變化

2.3.1 HE染色 對照組肺動脈管壁菲薄，內皮細胞扁平連續，細胞分布均勻，大小厚薄較一致。MCT組肺小動脈壁增厚伴玻璃樣變，管腔狹窄甚至閉塞，大量炎性細胞浸潤，以淋巴細胞為主；小血管壁正常結構喪失，有纖維素樣滲出，管周有淋巴細胞浸潤，肺泡壁上毛細血管淤血，肺間質增厚。MCT/MSCs 1×106組與MCT組相比彈力纖維變薄，而MCT/MSCs 5×105組亦變薄，但不及MCT/ MSCs 1×106組明顯(圖1)。

圖1 肺組織HE染色Fig. 1 HE staining of lung tissue

2.3.2 平滑肌actin免疫組化染色 對照組肺小動脈中層平滑肌厚度很薄；MCT組中層平滑肌明顯增厚；MCT/MSCs 1×106組及MCT/MSCs 5×105組中層平滑肌均較MCT組變薄(圖2)。

圖2 肺組織平滑肌actin免疫組織化學染色Fig. 2 Actin histochemical staining of smooth muscle in lung

2.3.3 彈力纖維染色 對照組肺腺泡內小動脈內外彈力板(花邊樣)呈深棕色，中層不增厚，管腔無狹窄；MCT組中層增厚，管腔狹窄；與MCT組相比MCT/MSCs 5×105組及MCT/MSCs 1×106組中層變薄，后者更為明顯(圖3)。圖像定量分析顯示，對照組肺小動脈中層厚度百分比明顯低于其余3組(P＜0.05)。與MCT組比較，MCT/MSCs 1×106組中層厚度明顯變薄(P＜0.05)，而MCT/MSCs 5×105組與MCT組比較差異無統計學意義(P＞0.05，表1)。

圖3 肺組織地衣紅染色Fig. 3 Orcein staining of lung tissues

3 討 論

臨床上PAH的診斷標準為靜息時平均肺動脈壓力＞25mmHg 或運動時＞30mmHg，右心導管是診斷和評估治療反應的金標準，同時還應排除左心系統疾病[6]。內皮細胞受損是PAH發生的主要機制，為了再生健康的內皮細胞，研究人員采用成體干細胞移植的方法進行了嘗試。

干細胞治療PAH的可能機制包括以下兩個方面。①干細胞整合到肺動脈內皮層：相對于其他臟器，肺微血管在解剖上是一種天然的生理性濾器，相對較大的粒子如懸浮細胞會定植于肺的微血管，因此在理論上對肺血管進行細胞移植可能取得較其他臟器更好的效果[7]。Ortiz等[8]認為骨髓間質細胞可以定植于博萊霉素損傷的肺組織，并可分化呈上皮細胞樣形態，減輕肺部炎癥和膠原沉積。研究顯示，移植的骨髓間質細胞在肺組織中長期存在，表現出高度的可塑性，并可保留其分化能力[9-12]。移植的內皮祖細胞(EPCs)可整合到PAH模型大鼠的肺小動脈和毛細血管中并分化為成熟的內皮細胞[2,13]。②干細胞具有刺激組織新生血管的能力，可以通過自分泌或旁分泌作用，降低肺動脈阻力。Baber等[14]對PAH模型大鼠進行研究發現，氣道移植MSCs后，肺血管對乙酰膽堿擴張劑的反應性增強，考慮是由于移植到肺實質中的干細胞雖未融合到血管，但可通過內分泌作用改善血管內皮功能，使側支血流輕度增加。EPCs既能融合到新生血管，又能刺激固有的血管功能，這是其能夠刺激血管新生和內皮修復的關鍵[15]。

目前關于移植骨髓間充質干細胞治療PAH的報道較少。移植人臍帶血來源的EPCs可中度減輕MCT誘導的PAH(肺血管阻力下降16%)，使肺動脈壓力下降14%[14]。本研究結果顯示，MSCs靜脈移植可減輕MCT導致的肺動脈壓力升高，1×106個MSCs可明顯降低RVSP，減輕肺動脈壓力升高導致的右心室肥厚，且肺小動脈中層厚度變薄，具有明顯的治療作用，其效果優于5×105個MSCs移植。何志旭等[16]也進行了MSCs治療PAH的研究，采用5×106個MSCs通過舌下靜脈移植，結果28d后移植MSCs的大鼠RVSP、右心指數均較MCT組降低，獲得了較好的效果。本研究采用的是中心靜脈(頸外靜脈)途徑移植，可能最終到達并定植于肺組織的細胞數目有所不同，其中的差別還需進一步研究。

綜上所述，MSCs靜脈移植是治療PAH的一種可嘗試的良好方法，可用于各種原因導致的PAH，還可進行轉基因以增強治療效果，但其具體機制及對不同嚴重程度PAH的療效尚需進一步深入研究。

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Therapeutic effect of mesenchymal stem cells transplantation on pulmonary hypertension model rats

ZHAO Ke-yan1, WANG Hui-shan1, HOU Ming-xiao1, LIU Ke-xiang2, WU Hui-ying2, LI Bo2
1Department of Cardiovascular Surgery, General Hospital of Shenyang Command, Shenyang 110016, China
2Department of Cardiovascular Surgery, Second Hospital of Jilin University, Changchun 130041, China
This work was supported by the "Eleventh Five-Year Plan" Medical and Health Research Foundation of PLA (08G004)

ObjectiveTo observe the therapeutic effect of mesenchymal stem cells (MSCs) transplantation on monocrotaline (MCT)-induced pulmonary hypertension in rats.MethodsMSCs were isolated from Wistar rats and cultivated by bone marrow adherent culture. The third to fifth passages of MSCs were used for cell transplantation. Forty male Wistar rats were randomly divided into control group, MCT group, MCT/MSCs 5×105group and MCT/MSCs 1×106group (10 each). MCT was injected intraperitoneally (60mg/kg), and MSCs were transplanted into rats through external jugular vein. Right ventricular systolic pressure (RVSP) of rats was determined, then the animals were sacrificed and the ventricular ratio (i.e. the mass ratio of right to left ventricle plus interventricular septum) was calculated. The lung tissue was observed by light microscopy after HE staining, orcein staining and smooth muscle actin immunohistochemical staining.Results Four weeks after MSCs administration, the RVSP and ventricular ratio were 35.6±8.4mmHg and 0.357±0.092 in MCT/MSCs 1×106group respectively, and significantly lower than those in MCT group (47.2±10.5mmHg and 0.445±0.094, respectively,P＜0.05), while the RVSP and ventricular ratio were 42.5±11.3mmHg and 0.400±0.073 in MCT/MSCs 5×105group, and no statistical difference was found when compared with MCT group (P＞0.05). Pathological observation found the intima-media thickness of pulmonary arterioles was 19.2%±3.8% in MCT/MSCs 1×106group, and significantly thinner than that in MCT group (26.4%±4.9%,P＜0.05), while it was 23.3%±3.6% in MCT/MSCs 5×105group and no significant difference was found when compared with MCT group (P＞0.05).ConclusionIntravenous MSCs administration could inhibit the MCT-induced pulmonary hypertension and 1×106is the optimal number of MSCs for transplantation.

mesenchymal stem cell transplantation; monocrotaline; hypertension, pulmonary

R541.5

A

0577-7402(2013)10-0830-04

10.11855/j.issn.0577-7402.2013.10.010

2012-12-03；

2013-08-21)

(責任編輯：胡全兵)

全軍“十一五”醫藥衛生科研基金(08G004)

趙科研，醫學博士，主治醫師。主要從事復雜先心病及肺動脈高壓的臨床治療工作

110016 沈陽 沈陽軍區總醫院心血管外科(趙科研、王輝山、侯明曉)；130041 長春 吉林大學第二醫院心血管外科(柳克祥、吳慧穎、李博)