毫米波輻照所致急性應激對小鼠細胞因子和Th1/Th2免疫平衡的影響

孫嶸，馬瓊，杜麗，蔡金玲，楊曉云，高艷，崔玉芳，毛建平

·軍事醫學·

毫米波輻照所致急性應激對小鼠細胞因子和Th1/Th2免疫平衡的影響

孫嶸，馬瓊，杜麗，蔡金玲，楊曉云，高艷，崔玉芳，毛建平

目的探討35GHz毫米波輻照誘發的小鼠急性應激細胞因子，尤其是Th1/Th2型因子的變化規律及其對免疫平衡的影響。方法BALB/c小鼠經35GHz、420mW/cm2功率密度的毫米波源急性輻照60s，紅外監測儀實時監測小鼠背部皮膚溫度變化。于輻照后不同時間點檢測小鼠外周血象、胸腺及脾臟指數，并用ELISA法檢測血清中IL-1β、IL-2、IL-6及Th1/Th2型細胞因子IFN-γ、IL-4的變化。結果輻照開始后小鼠耳廓溫度迅速升高到50℃，至輻照50～60s時升至約60℃。輻照后6h外周血白細胞(WBC)和淋巴細胞(LYM)出現明顯的一過性降低，至輻照后1～7d基本恢復至對照水平。胸腺指數在輻照后6h短暫升高后逐漸降低，至輻照后7d明顯低于對照組。脾臟指數在輻照后3、7d均出現明顯升高。外周血IL-1β在輻照后6h即迅速升高至峰值，1d降至最低(P＜0.05)，3～7d逐漸恢復至對照水平；而IL-6在輻照后6h～3d明顯升高，1d升至峰值，7d仍明顯高于對照組(P＜0.05)。Th1和Th2型細胞因子IFN-γ和IL-4在輻照后3d均升高至峰值，至7d仍明顯高于對照組(P＜0.01)。Th1/Th2(IFN-γ/IL-4)比值在輻照后1、3d分別增高為對照值的1.34和1.66倍(P＜0.05)。結論35GHz毫米波急性輻照小鼠能誘發明顯的熱效應，血清細胞因子應激性升高，Th1/Th2平衡明顯向Th1免疫方向偏移，表明免疫調節在毫米波輻照誘發的急性應激反應中發揮了重要的調節作用。

毫米波；應激；細胞因子類；免疫平衡

因毫米波(millimeter-wave，MMW)具有頻率高、波長短、有一定穿透力的特點，已被廣泛應用于無線通信、醫學、軍事等領域。目前，毫米波的生物效應及相關的防護研究備受關注。已有研究發現，毫米波輻照可引起體表溫度升高[1-2]，而高功率毫米波輻照對機體免疫系統影響的報道鮮見。免疫系統及其分泌的免疫因子組成了一個龐大、復雜而有序的網絡系統，其穩態調控對機體適應內外環境變化、特別是維持機體內環境的穩定至關重要。Th1和Th2型輔助性T細胞及其分泌的細胞因子在機體細胞免疫和體液免疫中發揮著重要的調節作用[3]。然而，急性應激時機體所產生的糖皮質激素對Th1/Th2免疫平衡的影響，能直接誘發機體對疾病的易感性[4]。據此，本實驗觀察35GHz毫米波輻照誘發的小鼠急性應激反應中的重要細胞因子，尤其是Th1/Th2型因子的變化規律，并重點分析Th1/ Th2免疫平衡的變化特點，以期能為毫米波誘發的免疫損傷機制及其醫學防護提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 雄性二級BALB/c小鼠30只，體重20±2.0g，購自軍事醫學科學院實驗動物中心，并飼養于該中心二級動物房。按照取材時間分為對照組、6h組和1、3、7d共5組，每組6只。

1.2 主要試劑 小鼠IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6及IFN-γ的ELISA檢測試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司。

1.3 輻照條件 小鼠背部剪毛后束縛四肢，采用35GHz、平均功率密度420mW/cm2的毫米波源進行輻照。輻照時間60s，對照組行假照射。輻照全程使用紅外監測儀實時監測小鼠背部皮膚溫度變化，并用視頻監控系統實時監測其行為學變化。

1.4 外周血血象分析 分別于輻照后5h和1、3、7d取小鼠尾靜脈血20μl，以全自動血細胞分析儀檢測外周血象的變化。

1.5 臟器指數 分別于輻照后6h和1、3、7d將小鼠稱重，取血后脫頸處死，解剖取出胸腺、脾臟稱重。根據公式[臟器指數=臟器質量(g)/體重(g)×100%]計算臟器指數。

1.6 ELISA法檢測血清細胞因子含量 分別于輻照后6h和1、3、7d經眼眶取血，離心收集血清，參照ELISA試劑盒說明書進行IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6及IFN-γ等細胞因子的檢測。具體步驟如下：將標本及不同濃度標準品加入酶標板，37℃孵育90min；洗板后加入生物素化抗體工作液，37℃孵育60min；洗板后加入酶結合物工作液，37℃孵育30min；洗板后加入顯色劑，避光孵育10～15min后加入終止液，混勻后在酶標儀上測量450nm處的吸光度(A)值。

1.7 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行分析。數據結果以表示，組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較，方差齊時采用LSD-t檢驗，方差不齊時采用Dunnett's T3法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 輻照過程中小鼠體表溫度和行為學變化 輻照前，小鼠無明顯躁動，體表溫度約為32℃(圖1A)。輻照開始后10～20s，小鼠即出現躁動不安，揚頸，耳廓溫度迅速升高到50℃以上(圖1B)。輻照50～60s時耳廓溫度升高到60℃，背部局部溫度也升高至約50℃(圖1C)。而輻照90s后，紅外監測顯示小鼠整個背部溫度均超過50℃(圖1D)。同時小鼠出現四肢僵硬、尾部上翹現象。所有輻照90s的小鼠存活均未超過24h。

圖1 毫米波急性輻照后小鼠體表溫度和行為學變化Fig.1 Changes of mouse shell temperature and ethology after acute MMW radiation

2.2 外周血象變化 小鼠外周血白細胞(WBC)在輻照后6h出現一過性降低(P＜0.05)，1d后逐漸恢復至正常水平。淋巴細胞(LYM)絕對數呈現相似的變化趨勢，而RBC輻照后未觀察到明顯改變(表1)。

表1 毫米波急性輻照后小鼠外周血象的變化s,n=6)Tab.1 Changes of peripheral haemogram after acute MMW radiation (±s,n=6)

表1 毫米波急性輻照后小鼠外周血象的變化s,n=6)Tab.1 Changes of peripheral haemogram after acute MMW radiation (±s,n=6)

(1)P＜0.05 compared with control group

GroupRBC(×1012/L)WBC(×109/L)LYM(×109/L) Control10.00±1.347.93±1.167.87±1.18 6h9.87±1.86 4.63±0.15(1)4.53±0.15(1)1d9.86±0.167.50±0.307.40±0.30 3d9.77±1.057.83±0.957.43±0.55 7d9.30±0.897.73±0.357.63±0.35

2.3 脾臟和胸腺指數變化 輻照后3、7d小鼠脾臟指數明顯高于對照組(表2)；而胸腺指數在輻照后6h即出現顯著升高(P＜0.01)，隨后逐漸降低，至7d時明顯低于對照組(P＜0.01)。

表2 毫米波急性輻照后小鼠臟器指數的變化Tab.2 Changes of mouse organ index after acute MMW radiation

2.4 外周血IL-1β、IL-6和IL-2含量的變化 輻照后6h，IL-1β即出現顯著升高(P＜0.05)，輻照后1d降至最低(P＜0.01)，3d后開始回升，至7d接近正常水平。IL-6在急性輻照后6h即明顯升高，1d升至峰值(P＜0.01)，而后出現下降，然而直至7d仍明顯高于對照組(P＜0.05)。IL-2水平在輻照后未見有統計學意義上的變化(圖2)。

圖2 毫米波急性輻照后小鼠血清IL-1β、IL-6和IL-2含量變化Fig.2 Changes of mouse serum IL-1β, IL-6 and IL-2 levels after acute MMW radiation

2.5 外周血Th1/Th2型細胞因子IFN-γ、IL-4含量的變化 IFN-γ在急性輻照后6h即出現明顯升高(P＜0.05)，3d達到峰值，7d時下降但仍明顯高于對照組(P＜0.01)。而IL-4在輻照后1～7d持續升高，均明顯高于對照組(P＜0.05或P＜0.01，圖3A)。

2.6 外周血Th1/Th2比值的變化 由于毫米波急性輻照后IFN-γ和IL-4各自升高的幅度不同(輻照后1、3d IFN-γ升高，分別為對照組的1.66和2.22倍，而IL-4僅為對照組的1.24和1.35倍)，導致Th1/ Th2(IFN-γ/IL-4)比值的顯著增高，輻照后1、3d該比值分別為對照值的1.34和1.66倍(P＜0.05)，即發生了明顯的Th1/Th2模式向Th1免疫反應偏移的現象(圖3B)，至輻照后7d恢復至正常水平。

3 討 論

圖3 毫米波急性輻照后小鼠外周血IL-4、IFN-γ含量(A)及Th1/Th2比值(B)的變化Fig.3 Changes of mouse serum IL-4, IFN-γ content (A) and Th1/Th2 ratio (B) after acute MMW radiation

毫米波頻率高，趨膚深度較小，可在皮膚局部產生明顯的熱效應[5]。本實驗中觀察到35GHz毫米波輻照短時間內小鼠耳廓溫度迅速升高到50℃，至輻照50～60s時約升高至60℃，顯示急性毫米波輻照引起了明顯的熱效應。這種熱效應不僅能引起局部的皮膚損傷，輻照時間達90s時可導致小鼠在24h內死亡，這一結果與王立斌等[6]及徐志偉等[7]的研究結果相同，這可能與毫米波急性輻照后動物體溫急劇升高、生理狀態及免疫功能急劇變化有關。據此在本實驗中采用35GHz毫米波輻照60s后觀察小鼠外周血象及細胞因子的變化規律，重點分析Th1/ Th2免疫平衡在急性輻照后的變化。

本實驗觀察到輻照后6h，小鼠外周血WBC、LYM出現一過性降低，可能是機體對毫米波急性輻照的全身性應激反應的結果。同時還觀察到胸腺指數早期(6h)即升高而后期(3～7d)則降低，而脾臟指數在輻照后3～7d時才出現明顯升高，表明毫米波輻照后，不同免疫器官顯示出不同的應激反應，作為中樞免疫器官的胸腺對急性毫米波輻照顯示出較高的敏感性，而脾臟作為外周免疫器官其臟器指數的增加，可能是應激誘導的代償性增殖，抑或是在本實驗輻照條件下毫米波可能對免疫系統具有雙向免疫調節作用。

已知在熱應激過程中能產生多種細胞因子，而且與神經內分泌系統的應激調節密切相關[8]。本實驗結果顯示，毫米波急性輻照所致的熱應激不僅可引起IL-1β、IL-6等細胞因子出現規律性改變，而且能使機體的免疫平衡發生改變。有文獻報道，IL-1β、IL-2和IL-6不僅具有多種免疫調節效應，而且還可以作用于下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)的不同位點，產生神經內分泌效應[9]。而Th1/Th2免疫平衡調節在神經內分泌和免疫系統的交互通訊中起著重要作用[10]。本實驗結果顯示，IL-1b、IL-6、IFN-γ和IL-4在毫米波急性輻照后0.25d即迅速升高，表明一方面小鼠細胞因子應激性合成分泌增加，另一方面這種增加可能與機體早期的炎癥反應有關。隨后(1d)IL-1β濃度雖明顯降低，但與機體炎癥反應相關的IL-6、IFN-γ和IL-4濃度仍明顯高于對照水平。然而，由于IFN-γ和IL-4升高的幅度不同，導致輻照后Th1/Th2比值出現顯著增高，即發生了Th1/Th2免疫平衡模式向Th1免疫反應明顯偏移的現象。以上結果表明，毫米波輻照急性應激不僅引起小鼠體內重要細胞因子發生改變，而且能使Th1/Th2免疫平衡系統發生明顯改變，導致機體防御功能紊亂。而毫米波輻照后7d，Th1/Th2免疫平衡的恢復可能與機體神經-內分泌-免疫網絡間的相互調節作用有關，這一推論尚需進一步的實驗證實。

綜上所述，小鼠經420mW/cm2毫米波急性輻照可引起明顯的熱效應，IL-1β、IL-6、IFN-γ和IL-4等細胞因子應激性升高，Th1/Th2免疫平衡改變，該結果為毫米波免疫損傷的機制及靶向研究提供了重要依據。

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Changes of mouse cytokines and Th1/Th2 balance in acute stress induced by millimeter-wave

SUN Rong, MA Qiong, DU Li*, CAI Jin-ling, YANG Xiao-yun, GAO Yan, CUI Yu-fang, MAO Jian-ping
Institute of Radiation and Irradiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China
*

, E-mail: lily5847@163.com
This work was supported by Open Issues of State key Laboratory of Millimeter Waves (K200909, K201225)

ObjectiveTo explore the regular pattern of variation of cytokines, especially the Th1/Th2 cytokines, and its effect on immune balance in stress induced by 35GHz millimeter-wave (MMW) exposure in mice.MethodsBALB/c mice were exposed to 420mW/cm2, 35GHz MMW for 60s, and the dorsal skin temperature was real-time monitored with infrared monitor during the period of exposure. Peripheral WBC, thymic and splenic indexes of mice were detected at different time points after MMW exposure. Meanwhile, the contents of serum IL-1β, IL-2, IL-6 and Th1/Th2 cytokines IFN-γ, IL-4 were analyzed by ELISA.ResultsThe temperature of ear auricle rapidly increased to 50℃ after initiation of exposure, and continuously rose to about 60℃at 50s to 60s. Peripheral WBC and lymphocytes showed transient reduction at 6h and restored to the control level from 1 to 7d after radiation exposure. Compared with control group, thymus index displayed a transient increase at 6h and thereafter decreased, and then diminished to which significantly lower than control level 7d after radiation exposure. However, spleen index increased significantly on day 3 and day 7 after radiation exposure. Peripheral IL-1β levels immediately increased to the maximum at 6h and decreased to the minimum at 1d (P＜0.05), then gradually recovered to control level during 3d and 7d after radiation exposure. However, IL-6 level displayed a significant increment from 6h to 3d, and increased to peak value at 1d and still obviously higher than that of control group up to 7d (P＜0.05) after radiation exposure. Simultaneously, Th1/Th2 cytokines IFN-γ and IL-4 both increased to the maximal at 3d and still significantly higher than those of control group at 7d (P＜0.01) after radiation exposure. Ratios of Th1/Th2 (IFN-γ/IL-4) evidently raised to 1.34 and 1.66 times of control values at 1d and 3d respectively (P＜0.05).Conclusions35GHz MMW exposure can induce obvious thermal effects in mice, and serum cytokines increase due to stress, the Th1/Th2balance drifts significantly to Th1 immune response, thus indicating that immune-regulation may play an important regulatory role in acute stress induced by MMW exposure.

millimeter-wave; stress; cytokines; immune balance

Q684

A

0577-7402(2013)10-0859-05

10.11855/j.issn.0577-7402.2013.10.017

2013-06-27；

2013-08-10)

(責任編輯：李恩江)

毫米波國家重點實驗室開放課題(K200909，K201225)

孫嶸，醫學博士，助理研究員。主要從事輻射免疫損傷機制及防護方面的研究

100850 北京 軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所(孫嶸、馬瓊、杜麗、蔡金玲、楊曉云、高艷、崔玉芳、毛建平)

杜麗，E-mail：lily5847@163.com