氯胺酮對幼齡小鼠自主活動的影響和致遺忘作用及其與GABAA、NMDA受體的關(guān)系Δ

高艷，趙佳佳，陳雪，高震，李偉，傅焓，張科學(xué)，戴體俊，王紅軍，張洋（徐州醫(yī)學(xué)院麻醉學(xué)院，江蘇徐州 221002）

氯胺酮（Ketamine，Ket）是臨床上常用的非巴比妥類靜脈麻醉藥，具有明顯的鎮(zhèn)痛作用[1]，在小兒麻醉的應(yīng)用中極為普遍。近年來，有研究[2]顯示，麻醉劑可能導(dǎo)致幼兒術(shù)后行為和發(fā)育問題。在體、離體動物實驗[3]也證明，在腦發(fā)育的高峰期，接受臨床劑量全身麻醉藥可使哺乳動物發(fā)育期腦神經(jīng)元產(chǎn)生損傷。另有眾多研究[4-5]發(fā)現(xiàn)，γ-氨基丁酸 A（GABAA）受體和N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體是許多全身麻醉藥的作用靶位，二者又均與記憶密切相關(guān)[6]。氯胺酮對成年小鼠具有致遺忘作用[7]也已被證實。但氯胺酮對幼齡小鼠自主活動的影響和致遺忘作用及其相關(guān)靶位未見文獻報道。故本實驗旨在闡明氯胺酮對幼齡小鼠自主活動的影響和致遺忘作用，及其在此過程中與GABAA、NMDA受體的關(guān)系，為臨床用藥提供參考。

1 材料

1.1 儀器

YLS-1A多功能小鼠自主活動記錄儀（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站）；ZH-500小鼠避暗儀（安徽省淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）；DT-200小鼠跳臺測試箱（成都泰盟科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

鹽酸氯胺酮注射液（福建古田藥業(yè)有公司，批號：100817，規(guī)格：0.1 g∶2 ml）；荷包牡丹堿（Bic，注射用無菌粉末，批號：44007045，規(guī)格：每支10 mg）和NMDA（注射用無菌粉末，批號：29k1198，規(guī)格：每支25 mg）均購自美國Sigma公司；人工腦脊液（aCSF，徐州醫(yī)學(xué)院教研室提供）。

1.3 動物

昆明種幼齡小鼠240只，清潔級，♀♂各半，8～10 d齡，體質(zhì)量8～13 g，由徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，許可證編號：SCXK（蘇）2010-0003。

2 方法

2.1 分組與給藥

將小鼠隨機均分為3大組分別用于自主活動、避暗和跳臺實驗，每大組再各分為8小組（n＝10）：A組[生理鹽水（NS）+aCSF]、B組（氯胺酮+aCSF）、C和D組（NS+Bic 0.10、0.20 mg/kg）、E和 F組（氯胺酮+Bic 0.10、0.20 mg/kg）、G 組（NS+NMDA 60 ng）、H組（氯胺酮+NMDA 60 ng）。氯胺酮100 mg/kg或NS于測試前20 min腹腔注射，aCSF或Bic或NMDA于測試前5 min側(cè)腦室注射。Bic和NMDA均以aCSF稀釋，側(cè)腦室注射容積均為每只5 μl，注射時間為5 s。氯胺酮以NS稀釋，腹腔注射容積均為10 ml/kg。

2.2 自主活動實驗

自主活動組小鼠側(cè)腦室注射藥物15 min后，用多功能小鼠自主活動記錄儀測試其5 min內(nèi)的自主活動次數(shù)（Spontaneous motor activity times，SMATs）。

2.3 避暗實驗[8]

實驗前，先將未給藥的避暗實驗組小鼠放入反應(yīng)箱內(nèi)適應(yīng)環(huán)境3 min，然后取出、給藥。向暗室底部銅柵通36 V、50 Hz交流電，再將側(cè)腦室注射藥物5 min后的避暗實驗組小鼠背對洞口放入明室，小鼠進入暗室則受到電擊，如此訓(xùn)練5 min。訓(xùn)練后24、48 h重復(fù)實驗。記錄小鼠第1次進入暗室的時間（即避暗潛伏期）和5 min內(nèi)受到的電擊次數(shù)（即錯誤次數(shù)）。若小鼠5 min未進入暗室，錯誤次數(shù)記為0次，避暗潛伏期記為300 s。

2.4 跳臺實驗[8]

實驗前，先將未給藥的跳臺實驗組小鼠放入反應(yīng)箱內(nèi)適應(yīng)環(huán)境3 min，然后取出、給藥。將側(cè)腦室注射藥物5 min后的跳臺實驗組小鼠放入反應(yīng)箱，以36 V、50 Hz交流電給予電擊，小鼠受電擊，正常反應(yīng)是跳回平臺以躲避傷害性刺激。多數(shù)小鼠可能再次或多次跳至銅柵上，受到電擊后又迅速跳回平臺，如此訓(xùn)練5 min。訓(xùn)練后24、48 h重復(fù)實驗。記錄小鼠第1次跳下平臺的時間（即跳臺潛伏期）和3 min內(nèi)受到電擊的次數(shù)（即錯誤次數(shù)）。若小鼠3 min未跳下平臺，錯誤次數(shù)記為0次，潛伏期記為180 s。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理

計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，各組比較采用單因素方差分析及LSD檢驗。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 氯胺酮對幼齡小鼠自主活動的影響

在自主活動實驗中，與A組比較，B組、E組、F組、H組小鼠自主活動次數(shù)均明顯增加（P＜0.05或P＜0.01），與B組比較，C組、D組小鼠自主活動次數(shù)均明顯減少（P＜0.05或P＜0.01）。各組小鼠自主活動實驗結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠自主活動實驗結(jié)果（ ±s，n＝10）Tab1 Results of spontaneous motor activity test of mice in each grou（ ±s，n＝10）

表1 各組小鼠自主活動實驗結(jié)果（ ±s，n＝10）Tab1 Results of spontaneous motor activity test of mice in each grou（ ±s，n＝10）

與A組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與B組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.groupA：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.group B：#P＜0.05，##P＜0.01

組別 自主活動次數(shù)19.4±14.5 47.5±20.3＊16.1±14.1#8.9±8.2##59.9±34.9＊＊64.0±55.9＊＊29.9±10.7 50.6±20.3＊ABCDEFGH

3.2 氯胺酮對幼齡小鼠的致遺忘作用

在避暗和跳臺實驗中，訓(xùn)練后24 h，與A組比較，B組、E組、F組小鼠的錯誤次數(shù)均明顯增加，避暗潛伏期和跳臺潛伏期均明顯縮短（P＜0.05或P＜0.01），表明氯胺酮使小鼠產(chǎn)生了遺忘作用；與A組比較，C組、D組小鼠的錯誤次數(shù)、避暗潛伏期和跳臺潛伏期均無明顯差異（P＞0.05），表明單獨使用0.10、0.20 mg/kg－1的Bic對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力無明顯影響；與B組比較，E組、F組小鼠的錯誤次數(shù)、避暗潛伏期和跳臺潛伏期均無明顯差異（P＞0.05），表明Bic未能拮抗氯胺酮所致的遺忘作用；與A組比較，G組小鼠的錯誤次數(shù)、避暗潛伏期和跳臺潛伏期均無明顯差異（P＞0.05），表明單獨使用60 ng NMDA對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力無明顯影響；與B組比較，C組、D組、G組、H組小鼠的錯誤次數(shù)均明顯減少，避暗潛伏期和跳臺潛伏期均明顯延長（P＜0.05），表明60 ng NMDA可拮抗氯胺酮所致的遺忘作用。訓(xùn)練后48 h，各組小鼠的錯誤次數(shù)、避暗潛伏期和跳臺潛伏期間均無明顯差異（P＞0.05）。各組小鼠避暗實驗結(jié)果見表2，各組小鼠跳臺實驗結(jié)果見表3。

表2 各組小鼠避暗實驗結(jié)果（ ±s，n＝10）Tab 2Results of step-through test of mice in each grou（±s，n＝10）

與A組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與B組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.groupA：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.group B：#P＜0.05，##P＜0.01

組別 訓(xùn)練后48 h ABCDEFGH避暗潛伏期，s 259±87 231±113 256±78 240±103 284±40 287±28 222±106 272±53訓(xùn)練后24 h錯誤次數(shù)0.5±0.5 2.2±1.5＊＊1.0±0.5#0.9±0.9#2.0±2.0＊＊1.6±1.3＊0.7±0.5##0.8±0.7##避暗潛伏期，s 212±110 60±38＊＊171±88#183±125##111±99＊92±87＊＊171±120#178±108#錯誤次數(shù)0.2±0.4 0.4±0.7 0.4±0.7 0.3±0.5 0.2±0.4 0.2±0.4 0.5±0.5 0.3±0.5

4 討論

本實驗結(jié)果表明，氯胺酮使幼齡小鼠自主活動次數(shù)增加，可能是增加了小鼠神經(jīng)興奮性。氯胺酮在用藥后24 h內(nèi)具有致遺忘作用，但48 h后該作用消失，可能是藥物已被基本消除之故，提示單次使用氯胺酮并未對幼齡小鼠造成長期的神經(jīng)損害。

跳臺和避暗實驗是常用的研究動物記憶的實驗方法。筆者由預(yù)實驗確定給藥劑量，幼齡小鼠腹腔注射100 mg/kg氯胺酮，結(jié)果其錯誤次數(shù)明顯增加，避暗潛伏期和跳臺潛伏期均明顯縮短，表明其對小鼠產(chǎn)生了明顯的遺忘作用。

表3 各組小鼠跳臺實驗結(jié)果（±s，n＝10）Tab 3Results of step-down test of mice in each grou（±s，n＝10）

表3 各組小鼠跳臺實驗結(jié)果（±s，n＝10）Tab 3Results of step-down test of mice in each grou（±s，n＝10）

與A組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與B組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.groupA：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.group B：#P＜0.05，##P＜0.01

組別 訓(xùn)練后24 h 訓(xùn)練后48 h ABCDEFGH跳臺潛伏期，s 272±55 242±94 227±79 226±73 206±89 210±92 202±84 215±98錯誤次數(shù)0.9±0.8 2.9±2.5＊1.0±1.1#1.1±1.0#2.7±2.5＊2.8±2.3＊1.4±1.2#0.9±1.0#跳臺潛伏期，s 219±79 91±67＊＊192±111#198±97#104±82＊79±88＊＊191±88#188±98#錯誤次數(shù)0.4±0.7 0.6±0.8 1.1±0.4 1.4±1.4 1.4±1.1 1.4±1.7 1.3±1.2 1.1±1.5

目前普遍認(rèn)為，GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要抑制性遞質(zhì)，目前已知其受體有3種類型：GABAA、GABAB、GABAC，其中GABAA受體是全身麻醉藥作用的重要靶位[5]。Bic是GABAA受體特異性阻滯藥。預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)側(cè)腦室注射Bic 0.25 mg/kg時，部分小鼠出現(xiàn)驚厥、抽搐。因此本研究以0.20 mg/kg為最高劑量，等比選擇0.10、0.20 mg/kg 2個劑量。結(jié)果顯示，上述劑量下，Bic并未明顯改變小鼠的錯誤次數(shù)、避暗潛伏期和跳臺潛伏期，提示GABAA受體并非氯胺酮引起遺忘作用的重要靶位。

谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要興奮性遞質(zhì)，谷氨酸受體分為兩大類：離子型受體和代謝型受體。其中NMDA受體是一種離子型受體，廣泛分布于海馬、皮層等與記憶密切相關(guān)的腦區(qū)，在記憶和長時程增強（Long-term potentiation，LTP）形成過程中發(fā)揮著重要作用。氯胺酮能阻斷各種刺激后產(chǎn)生的LTP效應(yīng)，從而干擾學(xué)習(xí)記憶過程[9]。NMDA是NMDA受體的特異性激動藥。預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)側(cè)腦室注射75 ng NMDA時，部分小鼠出現(xiàn)過度興奮、驚厥，90 ng則可引起小鼠死亡。故選用60 ng的劑量。結(jié)果顯示，在避暗和跳臺實驗中，與A組比較，G組小鼠的錯誤次數(shù)、避暗潛伏期和跳臺潛伏期均無明顯差異。與B組比較，H組小鼠的錯誤次數(shù)明顯減少，避暗潛伏期和跳臺潛伏期均明顯延長，提示NMDA能改善氯胺酮所致的遺忘作用。

綜上所述，在本實驗條件下，氯胺酮可致幼年小鼠自主活動次數(shù)增多且有顯著致遺忘作用；NMDA受體是氯胺酮致遺忘作用的重要靶位，而GABAA受體則不是。

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