HPLC法檢測降血糖保健食品中的雙胍類藥物Δ

王俊蘇，郗存顯，陳冬東，張雷，李賢良，彭濤，王國民#（.重慶出入境檢驗檢疫局/重慶市進出口食品安全工程技術研究中心，重慶 40000；.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 003）

雙胍類藥物用于糖尿病治療始于20世紀50年代，其中二甲雙胍是治療2型糖尿病的一線藥物，但過度服用會導致乳酸酸中毒，危及患者生命[1]；苯乙雙胍也因其可致較高的乳酸酸中毒發生率，在歐美國家已停止使用，在我國也已趨于淘汰[2]。由于雙胍類藥物的降血糖效果較好，一些不法分子在降血糖保健食品中違禁添加了這類藥物，而長期超量服用這些保健食品會嚴重危害患者的身體健康。為此，需要建立測定這類保健食品中雙胍類藥物的快速、可靠的方法。

目前，降血糖類保健食品中雙胍類藥物的測定方法主要有毛細管電泳法[3]、薄層色譜法[4-6]、高效液相色譜（HPLC）法[4-9]和液相色譜-質譜/質譜（LC-MS/MS）法[10-11]。其中，毛細管電泳法和薄層色譜法的選擇性較差，檢測結果容易受到其他因素的干擾；HPLC法具有快速、高分離度的優點，但多數方法未建立樣品的凈化方法[4-7]。由于保健食品成分復雜、基質干擾嚴重[12]，加之雙胍類藥物的極性強，在反相C18柱上保留時間較短，與雜質分離效果差，因此，采用HPLC測定時需要對樣品進行凈化，以提高方法的可靠性和靈敏度。

筆者采用超聲法提取降血糖保健食品中的二甲雙胍和苯乙雙胍，將提取液經弱陽離子型WCX固相萃取柱凈化后再進行HPLC測定，結果表明方法簡單、可靠、靈敏。具體報道如下。

1 材料

1.1 儀器

1200型HPLC儀，配有二極管陣列檢測器（DAD，美國Agilent公司）；Hei-VAP型旋轉蒸發儀（德國Heidolph公司）；3-30K型離心機（德國Sigma公司）；N-EVAP 116型氮吹儀（美國Organomation公司）；XH-B型旋渦混合器（江蘇康健醫療用品有限公司）；AS20500BDT型超聲波清洗器（天津市奧特賽恩斯儀器有限公司）；HH型恒溫水浴鍋（江蘇金壇市中大儀器廠）。

LC-WCX固相萃取柱、HLB固相萃取柱、LC-18固相萃取柱（美國Supelco公司）；MCX固相萃取柱（美國Waters公司）。

1.2 藥品與試劑

二甲雙胍標準品（鹽酸鹽，批號：100664-200602，純度：＞99%）、苯乙雙胍標準品（鹽酸鹽，批號：100922-201001，純度：＞99%）均由中國食品藥品檢定研究院提供；甲醇、乙腈、冰醋酸、庚烷磺酸鈉均為色譜純；無水乙醇、磷酸、磷酸氫二鉀均為分析純；試樣基質（降糖粉，A公司，生產日期：20090805，規格：每袋1 kg；奶粉，B公司，生產日期：20100120，規格：每袋300 g；口服液，C公司，生產日期：20080919，規格：每瓶250 ml；膠囊，D公司，生產日期：20090806，規格：250 mg×10粒×4板；清渴茶，E公司，生產日期：20100102，規格：每盒150 g）。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 標準貯備液。分別精確稱取二甲雙胍、苯乙雙胍標準品10 mg（精確至0.01 mg），用適量甲醇溶解并定容至100 ml，混勻，制備成二甲雙胍、苯乙雙胍質量濃度均為100 mg/L的標準貯備液。

2.1.2 混合標準工作液。分別精密量取二甲雙胍和苯乙雙胍貯備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 ml，置于100 ml量瓶中，加甲醇稀釋、定容，制備成二甲雙胍、苯乙雙胍質量濃度均為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L的混合標準工作液。

2.2 樣品的提取與凈化

2.2.1 提取。稱取1.0 g（精確到0.01 g）試樣于50 ml離心管中，加入10 ml甲醇-乙醇（50∶50，V/V），于旋渦混合器上混勻，超聲10 min，7 000 r/min離心3 min，轉移上層清液至100 ml旋蒸瓶中，再分別用10 ml甲醇-乙醇（50∶50，V/V）重復提取2次，合并上清液，旋蒸濃縮近干，用2 ml甲醇溶解殘渣，再加入8 ml水，混勻，待凈化。

2.2.2 凈化。LC-WCX固相萃取柱使用前依次用3 ml甲醇和3 ml水活化。將待凈化液全部轉移至LC-WCX固相萃取柱中，用3 ml甲醇-水（50∶50，V/V）淋洗小柱，抽空，再用5 ml 3%乙酸甲醇溶液（取3 ml冰乙酸與97 ml甲醇混合即得）洗脫，收集洗脫液，于40℃下氮氣吹干，殘渣用1.0 ml流動相溶解，過0.22 μm濾膜后供HPLC測定。

2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A為乙腈，流動相B為含庚烷磺酸鈉-磷酸氫二鉀的磷酸溶液（稱取庚烷磺酸鈉2.023 g、磷酸氫二鉀2.282 g到500 ml量瓶中，再取1 ml用水溶解并定容，過0.45 μm濾膜，即得），流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：270 nm；進樣量：10 μl；柱后平衡時間：3 min；梯度洗脫程序如表1所示。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab1 Gradient elution program of mobile phase

2.4 色譜專屬性考察

取“2.1.2”項下二甲雙胍和苯乙雙胍質量濃度均為5.0 mg/L的混合標準工作液，進樣測定，結果，二甲雙胍和苯乙雙胍的保留時間分別為8.5、17.9 min。稱取試樣清渴茶，按照“2.2”項下方法進行提取和凈化后進樣分析，記錄色譜圖；另取試樣清渴茶樣品，按5.0 mg/kg量添加二甲雙胍和苯乙雙胍后按照“2.2”項下方法進行提取、凈化后進樣分析，記錄色譜圖。結果表明，試樣清渴茶經提取、凈化后不存在干擾二甲雙胍和苯乙雙胍測定的物質。色譜見圖1。

2.5 基質回收標準曲線制備

圖1 高效液相色譜圖A.混合標準工作液；B.試樣；C.試樣+混合標準工作液；1.二甲雙胍；2.苯乙雙胍Fig1 HPLC chromatogramsA.mixed standard substance；B.test sample；C.test sample+mixed standard substance；1.metformin；2.phenformin

分別準確稱取試樣1.0 g（精確至0.01g）于50 ml離心管中，分別加入“2.1.2”項下系列質量濃度的混合標準工作液1 ml，按“2.2”項下方法提取、凈化，進樣分析；以質量濃度（x，mg/L）為橫坐標，以峰面積（y）為縱坐標繪制基質回收標準曲線。結果，二甲雙胍和苯乙雙胍的標準方程分別為y＝47.75x+0.21（r＝0.999 9）、y＝38.48x+1.33（r＝0.999 5），二者檢測質量濃度線性范圍均為0.1～5.0 mg/L。

2.6 定量限考察

分別稱取1.0 g（精確到0.01 g）清渴茶試樣共6份按0.1 mg/kg的量分別添加二甲雙胍和苯乙雙胍，并按照“2.2”項下方法進行提取、凈化后進樣分析，計算信噪比。結果表明，二甲雙胍和苯乙雙胍的信噪比均大于10，因此將二甲雙胍和苯乙雙胍的定量限定為0.1 μg/g。

2.7 回收率和精密度

文獻[4-8]均報道了1～3種保健食品試樣中雙胍類藥物的測定方法。本試驗采用的試樣基質有降糖粉、奶粉、口服液、膠囊、清渴茶5種保健食品，幾乎涵蓋了糖尿病患者服用的保健食品的所有種類，保障了試驗數據的代表性和檢測方法的適用性。采用上述基質，分別按照1.0、2.0、5.0 mg/kg 3個水平進行添加回收試驗，每個濃度水平分析6次。結果，二甲雙胍和苯乙雙胍的平均回收率分別為91.9%～102.7%、89.8%～107.0%，RSD均小于9.46%，具體結果見表2。

2.8 試樣分析

取5種試樣，分別進行提取、凈化后進樣分析，結果，5種試樣中均未檢出二甲雙胍和苯乙雙胍。

3 分析與討論

3.1 提取溶劑的選擇

以清渴茶為基質，按1 mg/kg添加二甲雙胍和苯乙雙胍，考察不同溶劑（甲醇、乙醇、乙腈及混合溶劑）對雙胍類藥物的提取效率，結果見表3。

由表3可見，甲醇-乙醇（50∶50，V/V，含3%乙酸）及甲醇-乙醇（50∶50，V/V）對二甲雙胍和苯乙雙胍的提取效率較其他溶劑好。由于2種提取溶劑中二甲雙胍的回收率都在80%以上，故根據苯乙雙胍的回收率值的高低來選取提取溶劑。其中甲醇-乙醇（50∶50，V/V）作為提取溶劑時苯乙雙胍的回收率相對較高，故最終以其為提取溶劑，并采用基質回收標準曲線進行定量，以彌補添加水平較低時前處理過程中雙胍類藥物的損失，可使回收率滿足要求。

表2 二甲雙胍和苯乙雙胍的回收率結果（n＝6）Tab 2Recovery rates of metformin and phenformin（n＝6）

表3 不同提取溶劑對二甲雙胍和苯乙雙胍回收率的影響Tab3 Influence of different extraction solvent on recoveries of metformin and phenformin

3.2 提取方式的選擇

前期試驗比較了超聲波提取、旋渦振蕩提取和微波提取3種提取方式的提取效果。結果顯示超聲波和旋渦振蕩均能提高提取效率，而微波提取對回收率沒有明顯的影響，因此選用先旋渦振蕩后超聲提取10 min的提取方式。

3.3 固相萃取柱和洗脫溶劑的選擇

固相萃取是一種基于“相似相溶”原理進行分離和凈化的技術[13]。前期試驗中比較了LC-WCX、MCX、HLB、LC-18等固相萃取柱對樣品的凈化效果；同時，試驗了甲醇、5%氨化甲醇（取5 ml氨水與95 ml甲醇混合即得）、3%乙酸甲醇作為洗脫溶劑的洗脫效率。結果表明，雙胍類藥物在HLB和LC-18柱上基本不保留；而由于雙胍類藥物與強陽離子型MCX柱中的陰離子作用力較強，采用MCX柱時3種洗脫溶劑均難以洗脫藥物，只有采用文獻[8]中較強的甲醇-0.4 mol/L氫氧化鈉溶液（60∶40，V/V）才能有效地洗脫，故MCX柱不適合采用；采用作用力相對較弱的弱陽離子型LC-WCX柱凈化時，以3%乙酸甲醇溶液作為洗脫溶劑，利用溶劑中的氫離子（H+）與LC-WCX柱上吸附的雙胍類藥物發生離子交換，使之解離而被有效地洗脫。因此，本試驗最終采用LC-WCX柱，以5 ml、3%乙酸甲醇溶液作為洗脫溶劑用于樣品的凈化。

3.4 液相色譜柱的選擇

反相C18色譜柱常用于雙胍類藥物的分離[4-9]。由于雙胍類藥物屬于強極性含氮化合物，在反相色譜柱上保留較差，同時還容易產生二次保留作用，從而發生色譜峰拖尾現象[8]。在流動相中加入酸性緩沖鹽[6-8]，或加入庚烷磺酸鈉、十二烷基磺酸鈉[4-5]等離子對試劑，能夠抑制雙胍類藥物的電離，增強雙胍類藥物的保留和避免拖尾。前期曾試驗用Shimadzu VP-ODS C18（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）、Waters Xetrra MS C18（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）、Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）3種反相色譜柱進行試驗，并在流動相中加入磷酸鹽緩沖液和0.01 mol/L庚烷磺酸鈉對雙胍類藥物進行分離。結果表明，Shimadzu VP-ODS C18、Waters Xetrra MS C18不能很好地保留二甲雙胍，出峰時間較快，峰形不好；Agilent SB-C18對二甲雙胍和苯乙雙胍都能很好地保留，峰形較好，響應強度較高。因此本試驗采用Agilent SB-C18色譜柱分離二甲雙胍和苯乙雙胍。

筆者建立了同時測定降血糖類保健食品中二甲雙胍和苯乙雙胍的HPLC方法。方法采用基質回收標準曲線定量，解決了添加濃度較低時回收率較低的問題；建立了弱陽離子型固相萃取柱凈化方法，能有效去除雜質的干擾；研究了降糖粉、奶粉、口服液、膠囊、清渴茶5種基質中雙胍類藥物的回收率，保障了試驗數據的代表性和檢測方法的實用性。結果表明，建立的方法線性范圍寬、精密度高、回收率較好，具有簡單、可靠、靈敏等特點，可用于降血糖保健食品中雙胍類藥物的監測。

[1]Howlett HCS，Bailey CJ.Arisk-benefit assessment of metformin in type 2 diabetes mellitus[J].Drug Safety，1999，20（6）：489.

[2]Coronho V，da Silva OA，López M.Acute selfpoisoning with phenformin[J].Acta Diabetol Lat，1976，13（3/4）：130.

[3]鄒定，何笑榮，吳學軍，等.毛細管電泳色譜分析同時測定復方降糖制劑中3種組分的含量[J].中國醫院藥學雜志，2006，26（3）：360.

[4]張妤琳，曹玲.降糖保健食品中非法添加鹽酸苯乙雙胍和格列本脲的檢測[J].藥學與臨床研究，2007，15（5）：423.

[5]潘字宏，王仕平，晏敏英，等.降糖類藥品與保健食品中摻入鹽酸苯乙雙胍的檢測方法[J].中國藥業，2008，17（16）：36.

[6]羅干明.降糖類中藥及保健食品中摻入的鹽酸苯乙雙胍檢測[J].中國藥業，2009，18（4）：31.

[7]余倩，車寶泉.RP-HPLC檢查中藥保健品中的西藥降糖成分[J].中國藥學雜志，2005，40（4）：316.

[8]朱炳輝，龍朝陽，吳西梅，等.固相萃取/高效液相色譜法對中成藥和保健品中7種降糖化學藥物的測定[J].分析測試學報，2008，27（5）：534.

[9]郭棟，那順朝克圖，王江華，等.高效液相色譜法測定降糖中成藥中添加的高極性化學降糖藥物[J].色譜，2009，27（2）：211.

[10]李曉燕，劉斐，鄭靜，等.液質聯用檢查降糖中藥制劑中摻入的7種化學藥品[J].中國藥事，2008，22（11）：980.

[11]張吉吉，高青，余倩，等.中藥制劑及保健品中違禁添加9種化學降糖藥的HPLC-MS/MS定性檢測[J].中國醫藥工業雜志，2007，38（1）：39.

[12]謝瑤，石萌萌，龐欣.高效液相色譜及液相色譜-質譜聯用技術在保健食品檢測中的應用[J].化學通報，2010（8）：684.

[13]鄭建國，周明輝，李政軍.化學檢測樣品前處理技術研究進展[J].檢驗檢疫學刊，2011，21（6）：1.