注射用鹽酸吉西他濱細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的研究

周 梅，武 谷（安徽省食品藥品檢驗(yàn)所，合肥 230051）

鹽酸吉西他濱全稱為2′-脫氧-2′，2-二氟胞嘧啶鹽酸鹽（β異構(gòu)體），其結(jié)構(gòu)與阿糖胞苷類(lèi)似，是新一代抗代謝藥。鹽酸吉西他濱作為一種前藥在細(xì)胞內(nèi)是脫氧胸苷激酶磷酸化的良好底物。注射用鹽酸吉西他濱（β異構(gòu)體）為注射用無(wú)菌凍干粉末，用于治療局部晚期或已轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌[1]。現(xiàn)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)采用熱原方法進(jìn)行其生物安全性質(zhì)量檢查。筆者按照《中國(guó)藥典》2010年版（二部）“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”[2]，對(duì)注射用鹽酸吉西他濱進(jìn)行了細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的研究，以探討其代替熱原檢查法的可行性。

1 材料

1.1 儀器

S648恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械七廠）；HS-1300凈化工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰公司）；MS3digital旋渦混旋器（德國(guó)IKA公司）；試驗(yàn)所用容器和用具均經(jīng)250℃干烤2 h。

1.2 藥品與試劑

注射用鹽酸吉西他濱（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20100924、20100925、20100926，規(guī)格：每支0.2 g）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：150601-200966，規(guī)格：每支120 EU）；鱟試劑（湛江博康海洋生物有限公司，批號(hào)：10103012；福州新北生化工業(yè)有限公司，批號(hào)：1106010；靈敏度：均為0.25 EU/ml）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET，福州新北生化工業(yè)有限公司，批號(hào)：10060321，規(guī)格：每支100 ml）。

2 方法與結(jié)果

2.1 鱟試劑靈敏度復(fù)核

用BET將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶解，置于混旋器混合15 min，然后制成0.5、0.25、0.125、0.062 6 EU/ml的稀釋液，依據(jù)《中國(guó)藥典》[2]2010年版二部附錄方法[2]進(jìn)行復(fù)核試驗(yàn)。結(jié)果，鱟試劑靈敏度的測(cè)定值（λc）均在0.5λ～2λ之間，表明所用鱟試劑均可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，結(jié)果詳見(jiàn)表1（表中“+”表示凝膠形成，“-”表示凝膠未形成）。

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核結(jié)果Tab1 TALsensitivity check results

2.2 細(xì)菌內(nèi)毒素理論限值的確定[3]

參考注射用鹽酸吉西他濱的說(shuō)明書(shū)，其臨床使用最大劑量為1 250 mg/m2（人的體表面積按1.62 m2計(jì)），因此M（M為人用每千克體質(zhì)量每小時(shí)的最大供試品劑量）定為1 250×1.62/60（kg·h）；內(nèi)毒素限值（L）按公式L＝K/M（K為人每千克體質(zhì)量每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量）計(jì)算：L＝5 EU/（kg·h）×60 kg×1 h/1 250/1.62 mg＝0.148 EU/mg。根據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版（二部）“化學(xué)藥品注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則”要求[2]，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查限值按規(guī)定要求計(jì)算，由于藥物和適應(yīng)證（如抗感染、抗腫瘤、心血管藥等急重病癥用藥，兒童老人用藥，復(fù)合用藥，大輸液等）的不同，限值可適當(dāng)嚴(yán)格，即至計(jì)算值的1/3～1/2，以保證安全用藥。因此將注射用鹽酸吉西他濱細(xì)菌內(nèi)毒素理論限值確定為每1 mg吉西他濱中含細(xì)菌內(nèi)毒素的量不得過(guò)0.10 EU。

2.3干擾試驗(yàn)最小有效稀釋質(zhì)量濃度c（mg/ml）的計(jì)算

根據(jù)公式：最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）＝cL/λ，并考慮到目前市售鱟試劑有0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.03 EU/ml 5種靈敏度，對(duì)于規(guī)格為0.2 g的樣品MVD0.5-0.03＝0.14 EU/mg×200 mg/ml/（0.5～0.03）EU/ml＝56倍～933倍，則該品種最小有效稀釋質(zhì)量濃度c為3.57～0.214 mg/ml。

2.4 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋

用BET將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成0.5、0.25、0.125、0.062 5 EU/ml系列內(nèi)毒素溶液備用，作為Es系列。

2.5 供試品的干擾預(yù)試驗(yàn)[4]

為確定注射用鹽酸吉西他濱對(duì)方法的影響，首先采用直接稀釋法進(jìn)行供試品干擾預(yù)試驗(yàn)。用BET將樣品溶解，制備成不同質(zhì)量濃度的溶液：0.25、0.5、1.0、2.0、3.5、7.0 mg/ml溶液，記為SW系列；另再分別制備1份同樣質(zhì)量濃度的供試品溶液，在制備中加入內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，使每一水平的樣品溶液中含2λc的內(nèi)毒素，記為SE系列。選用靈敏度λc為0.25 EU/ml的鱟試劑分別與SW和SE反應(yīng)，相應(yīng)得供試品陰性對(duì)照（NPC）系列和供試品陽(yáng)性對(duì)照（PPC）系列，每一稀釋質(zhì)量濃度平行做2個(gè)反應(yīng)管，同時(shí)做BET陰性對(duì)照（NC）和陽(yáng)性對(duì)照（PC）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如果采用直接稀釋法，即使將供試品稀釋至0.25 mg/ml時(shí)對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素和鱟試劑的反應(yīng)也有干擾。

取注射用鹽酸吉西他濱1支，加BET 10 ml，搖勻，測(cè)其pH值為3.07。由于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查試驗(yàn)pH值最佳范圍為6.0～8.0，因此將上述溶液調(diào)節(jié)pH值在6.0～8.0之間，再進(jìn)行干擾預(yù)試驗(yàn)。稱取碳酸鈉適量置于無(wú)菌容器中，加BET制備成1 mol/L的溶液；取注射用鹽酸吉西他濱1支，加BET 10 ml，搖勻，取碳酸鈉溶液適量加入此溶液中，調(diào)節(jié)pH值至7.0，再進(jìn)行干擾預(yù)試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 供試品干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果Tab2 Results of interference pretest of samples

表2結(jié)果表明，供試品質(zhì)量濃度在0.25～3.5 mg/ml時(shí)對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素和鱟試劑的反應(yīng)未見(jiàn)干擾，故取供試品質(zhì)量濃度為3.5 mg/ml進(jìn)行干擾試驗(yàn)以進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.6 供試品干擾試驗(yàn)

取注射用鹽酸吉西他濱1支，加BET 10 ml，搖勻，取1 mol/L的碳酸鈉溶液適量加入此溶液中，調(diào)節(jié)pH值至7.0，再用BET稀釋至3.5 mg/ml。采用2個(gè)不同廠家的鱟試劑，按2010年版《中國(guó)藥典》（二部）附錄[2]方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 供試品干擾試驗(yàn)結(jié)果Tab3 Results of interference test of samples

從表3結(jié)果可知，上述供試品的Et均在0.5Es～2.0Es之間，即供試品質(zhì)量濃度在3.5 mg/ml時(shí)與2個(gè)廠家的鱟試劑試驗(yàn)均不產(chǎn)生干擾。根據(jù)公式MVD＝cL/λ，當(dāng)供試品為注射用無(wú)菌粉末時(shí)MVD取1，計(jì)算此時(shí)L值為0.07 EU/mg，低于確定的理論值。因此可采用L值為0.10 EU/mg對(duì)注射用鹽酸吉西他濱進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

2.7 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

取注射用鹽酸吉西他濱1瓶，加BET 10 ml溶解，再加碳酸鈉溶液適量（調(diào)pH至7.0），用BET將樣品稀釋成2.5 mg/ml（L值為0.10 EU/mg）的溶液，用靈敏度為0.25 EU/ml的鱟試劑檢查，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果Tab4 Results of endotoxin detection of samples

表4檢測(cè)結(jié)果顯示，樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素含量均低于0.10 EU/mg。

3 討論

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法是通過(guò)鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素間產(chǎn)生凝聚反應(yīng)以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素是否符合規(guī)定的一種方法，其具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)周期短、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，可替代家兔熱原檢查法用于注射液的質(zhì)量控制。由于不同廠家生產(chǎn)的鱟試劑的抗干擾能力存在差別，為保證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，該試驗(yàn)一般選擇2個(gè)廠家生產(chǎn)的鱟試劑對(duì)樣品進(jìn)行干擾試驗(yàn)。通過(guò)預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本品對(duì)鱟試劑凝集反應(yīng)具有較強(qiáng)的抑制作用，僅通過(guò)稀釋的方法不能排除干擾。為此，筆者分析了該藥的組成及溶液的pH值。由于本品的主要成分為鹽酸吉西他濱，輔料為甘露醇、醋酸鈉和氫氧化鈉，測(cè)其pH值為3.07，而適合鱟試劑反應(yīng)水平的pH值范圍為6.0～8.0，藥物pH值偏酸或偏堿，超出了鱟試劑緩沖能力就會(huì)抑制或促進(jìn)凝聚的形成。因此，本試驗(yàn)采用1 mol/L的碳酸鈉溶液調(diào)pH值至7.0。結(jié)果表明調(diào)pH值后再稀釋至3.5 mg/ml時(shí)就可以排除本品對(duì)鱟試劑凝集反應(yīng)的干擾作用。因此將L值定為0.10 EU/mg，并認(rèn)為注射用鹽酸吉西他濱采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法代替家兔熱原檢查法進(jìn)行生物安全性質(zhì)量檢查是可行的。

[1]金薇，楊永健.高效毛細(xì)管電泳分離和測(cè)定注射用鹽酸吉西他濱中有關(guān)物質(zhì)[J].藥物分析雜志，2004，24（5）：476.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：二部[S].2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010年：附錄99-102.

[3]國(guó)家藥典委員會(huì).臨床用藥須知：二部[S].2000年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000：573.

[4]葉青，王偉，迪麗努爾·沙比托夫.鹽酸多巴胺注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的研究[J].中國(guó)藥房，2010，21（41）：3 918.