LC-MS/MS法測(cè)定大鼠血漿中維拉帕米與其代謝產(chǎn)物去甲維拉帕米的濃度及其藥動(dòng)學(xué)研究

鄭俠，劉昌輝，王寧生，宓穗卿（.廣州中醫(yī)藥大學(xué)臨床藥理研究所，廣州50405；2.廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣東佛山 528248）

維拉帕米（Verapamil，Ver）屬于第1代苯基烷胺類(lèi)鈣離子通道拮抗藥，臨床上被廣泛應(yīng)用于治療心律失常、高血壓、缺血性心臟病以及肥厚性心肌病等。近年Ver在陣發(fā)性室上性心動(dòng)過(guò)速方面研究也有報(bào)道[1-2]。Ver口服給藥后吸收迅速，首關(guān)代謝強(qiáng)，生物利用度低（10%～20%）[3]。去甲維拉帕米（Norverapamil，Nor）是Ver的主要代謝產(chǎn)物之一，其主要由細(xì)胞色素P450（CYP）3A4酶代謝[4]。筆者建立一種快速、靈敏、簡(jiǎn)便、取樣量少的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法檢測(cè)Ver與Nor在大鼠體內(nèi)的血藥濃度，旨在為臨床進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

API4000型LC-MS/MS儀，包括電噴霧離子源（ESI）、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國(guó)AB公司）；1200型液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)Agilent公司）。

1.2 藥品與試劑

Ver對(duì)照品（批號(hào)：V4629，純度：＞98%）、Nor對(duì)照品（批號(hào)：V108-20MG，純度：＞98%）和他莫昔芬對(duì)照品（內(nèi)標(biāo)，批號(hào)：T5648，純度：＞99%）均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；甲醇、甲酸為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

SD大鼠6只，♂，體質(zhì)量（280±30）g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCKX（粵）2008-0002。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

精密稱(chēng)取Ver、Nor和內(nèi)標(biāo)對(duì)照品各10 mg，分別置于10 ml量瓶中，加5 ml甲醇使其溶解，用甲醇定容至10 ml，得1 mg/ml的母液，用時(shí)用甲醇稀釋至所需質(zhì)量濃度即可。

2.2 色譜條件與質(zhì)譜條件

色譜柱：Alltima-C18（150 mm×2.1 mm，5 μm），保護(hù)柱：Alltima-C18；流動(dòng)相：甲醇-0.05%甲酸水（梯度洗脫，具體程序：0～0.1 min為0→45%甲醇，0.1～0.6 min為45%甲醇，0.6～1.1 min為45%→98%甲醇，1.1～7.3 min為98%甲醇，7.3～8.3 min為98%→45%甲醇，8.3～14.5 min為45%甲醇），流速：0.3 ml/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μl。

ESI源；檢測(cè)方式：正離子檢測(cè)；掃描方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM）；Ver、Nor和他莫昔芬的選擇檢測(cè)離子質(zhì)荷比（m/z）分別為 455.3/165.0（[M+1]+）、441.0/165.0（[M+1]+）、372.2/129.1（[M+1]+）；霧化氣流速：30 L/min；干燥氣流速：30 L/min；干燥氣溫度：400℃；檢測(cè)器電壓：4 500 V。

2.3 血漿樣品的采集與處理

2.3.1 血漿樣品的采集：取大鼠6只，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水，參照文獻(xiàn)[5]擬定藥動(dòng)學(xué)研究方案，灌胃給藥Ver 10 mg/kg，于給藥前和給藥后0.17、0.25、0.5、1、2，3、4、6、8、12、24 h眼眶靜脈叢采血100 μl，置于1.5 ml肝素化的塑料管中，于4 ℃、1 500×g離心10 min分離血漿，置于－80℃冷凍貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 血漿樣品的處理：取血漿20 μl，加入1 μg/ml內(nèi)標(biāo)對(duì)照品溶液5 μl，渦旋振蕩30 s，加入甲醇100 μl，渦旋振蕩3 min，16 000×g離心10 min，取上清液5 μl進(jìn)樣測(cè)定。

2.4 方法專(zhuān)屬性考察

取大鼠空白血漿、空白血漿+Ver+Nor+內(nèi)標(biāo)、血漿樣品（給藥后2 h）+內(nèi)標(biāo)，依法處理后進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，空白血漿對(duì)檢測(cè)無(wú)干擾，Ver、Nor和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為5.78、5.77、6.77 min。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+Ver+Nor+內(nèi)標(biāo)；C.血漿樣品+內(nèi)標(biāo)Fig1 LC-MS/MS chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma+Ver+Nor+internal standard；C.plasma sample+internal standard

2.5 線(xiàn)性關(guān)系與最低檢測(cè)限考察

取空白血漿20 μl，加入一定質(zhì)量濃度的Ver、Nor對(duì)照品溶液 5 μl，制成Ver、Nor均為2、5、10、20、50、100、200、500、1 000 ng/ml的血漿樣品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣測(cè)定。以Ver、Nor質(zhì)量濃度（c）為橫坐標(biāo)，Ver、Nor分別與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸。得Ver、Nor的回歸方程分別為：Y＝20.539c－0.940 4（r＝0.999 4）、Y＝47.789c+0.503 9（r＝0.999 2），二者檢測(cè)質(zhì)量濃度的線(xiàn)性范圍均為2～1 000 ng/ml，最低檢測(cè)限均為0.5 ng/ml（信噪比＞3）。

2.6 回收率與精密度試驗(yàn)

取空白血漿20 μl，制備成Ver、Nor質(zhì)量濃度分別為5、50、500 ng/ml的血漿樣品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)行5樣本分析，連續(xù)測(cè)定3 d，根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品質(zhì)量濃度，分別計(jì)算絕對(duì)回收率、相對(duì)回收率、日內(nèi)RSD、日間RSD，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率與精密度試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）Tab 1Results of recovery and precision tests（n＝5）

2.7 穩(wěn)定性考察

取大鼠空白血漿20 μl，制備成Ver、Nor質(zhì)量濃度分別為5、50、500 ng/ml的血漿樣品，室溫放置28 d（測(cè)定時(shí)間為放置1、7、14、21、28 d）及－80℃反復(fù)凍融5次（測(cè)定時(shí)間為凍融后2、4、6、8、10 h），于相應(yīng)測(cè)定時(shí)間測(cè)定Ver與Nor的質(zhì)量濃度。結(jié)果，3個(gè)質(zhì)量濃度血漿樣品中Ver與Nor的RSD均＜5%，表明Ver與Nor在室溫放置及反復(fù)凍融條件下均穩(wěn)定。

2.8 藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)

取“2.3.1”項(xiàng)下各時(shí)間點(diǎn)的血漿樣品，處理后進(jìn)樣測(cè)定Ver與Nor的血藥濃度，繪制藥-時(shí)曲線(xiàn)。用3p97軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。Ver和Nor在大鼠體內(nèi)的藥-時(shí)曲線(xiàn)見(jiàn)圖2，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2。

圖2 Ver和Nor在大鼠體內(nèi)的藥-時(shí)曲線(xiàn)（n＝6）Fig2 Plasma concentration-time profiles of Ver and Nor in rats（n＝6）

表2 Ver和Nor在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n＝6）Tab2 Pharmacokinetic parameters of Ver and Nor in rats（±s，n＝6）

表2 Ver和Nor在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n＝6）Tab2 Pharmacokinetic parameters of Ver and Nor in rats（±s，n＝6）

參數(shù)Ke，/h t1/2，h tmax，h cmax，ng/ml AUC0-24 h，ng·h/ml AUC0-∞，ng·h/ml Ver 0.307±0.014 2.26±0.31 0.48±0.23 669.91±80.99 1 320.78±165.04 1 331.33±165.20 Nor 0.286±0.029 2.44±0.29 1.26±0.47 681.86±79.79 2 179.68±275.99 2 341.66±201.20

由上述結(jié)果表明，Ver和Nor在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)符合二房室模型。

3 討論

Ver藥動(dòng)學(xué)研究在國(guó)內(nèi)已有相關(guān)報(bào)道[6-7]，但采用LC-MS/MS同時(shí)測(cè)定Ver及其代謝產(chǎn)物Nor在大鼠體內(nèi)血藥濃度的方法在國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本文建立的方法，每個(gè)樣本僅需血漿100 μl，整個(gè)藥動(dòng)學(xué)研究過(guò)程采血量少，一只大鼠可完成一條完整的藥-時(shí)曲線(xiàn)，且在整個(gè)采血過(guò)程中大鼠的狀態(tài)比較好，這樣就能更真實(shí)地反映Ver在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)過(guò)程。

在建立LC-MS/MS法的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，筆者曾選用等度洗脫，洗脫時(shí)間為5 min，但是峰形較差、響應(yīng)值不高。通過(guò)調(diào)節(jié)pH、流速和流動(dòng)相比例，峰形、響應(yīng)值都有所改善，但效果不是很理想。而采用梯度洗脫，雖然分析時(shí)間延長(zhǎng)了，但峰形和響應(yīng)值都有了很大改善。等度洗脫時(shí)，Ver、Nor和內(nèi)標(biāo)的半峰寬分別是0.4、0.4、0.5 min；而梯度洗脫時(shí)，Ver、Nor和內(nèi)標(biāo)的半峰寬分別是0.1、0.1、0.3 min，大大提高了檢測(cè)的靈敏度。本研究建立的方法可為臨床上Ver的藥動(dòng)學(xué)研究提供可靠的參考。

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