果膠酶酶解法輔助超聲波法提取山楂中總黃酮的初步工藝優(yōu)化

高文秀，趙文卓，李平平

(吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林132022)

近年來(lái)，隨著黃酮類化合物的開發(fā)與應(yīng)用，山楂中總黃酮的提取也愈加深入.研究表明山楂中的黃酮類化合物是降血壓、降血脂、增加冠脈流量、抗心律失常的有效成分，是評(píng)價(jià)山楂質(zhì)量的重要依據(jù)［1-5］.目前對(duì)于山楂中黃酮類化合物的研究現(xiàn)多集中在葉，而山楂果實(shí)中黃酮類化合物含量豐富，因此本文利用酶解輔助超聲波法對(duì)山楂果實(shí)中黃酮類化合物進(jìn)行提取，并對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化.

山楂果實(shí)的細(xì)胞壁主要成分是果膠和纖維素，果膠酶可破壞其果膠成分，有利于細(xì)胞中黃酮類化合物的溶出［6］.而超聲波振動(dòng)可引起細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)動(dòng)，使細(xì)胞漿流動(dòng)、細(xì)胞震蕩，從而使細(xì)胞壁變薄.利于溶劑與植物細(xì)胞內(nèi)部的相互滲透，增加了有效成分在溶劑中的溶解［7-9］.目前對(duì)山楂中總黃酮的提取多采用大孔樹脂提取法、熱回流法、醇提法、超聲波提取法、酶解法等［10-16］，但采用果膠酶酶解法輔助超聲法提取山楂果實(shí)中總黃酮的方法還未見(jiàn)報(bào)道.因此，本文采用果膠酶酶解法和超聲波法相結(jié)合，可以優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，在溫和可控的條件下提取更多的黃酮類化合物.

1 藥品與儀器

1.1 儀器設(shè)備

RT-08粉碎機(jī)(榮聰精密科技有限公司)，DHG-9075A電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司)，F(xiàn)A2004N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，KQ-250B超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)，722N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海欣茂儀器有限公司)，HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(國(guó)華電器有限公司)，80-1型離心機(jī)(江蘇省金壇市正基儀器有限公司)

1.2 原料與試劑

山楂(吉林吉林)，槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品(科翔生物)，果膠酶(活力≥50 U/g，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，無(wú)水氯化鋁(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)，無(wú)水乙醇(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 原料預(yù)處理

將干燥后的山楂果實(shí)粉碎過(guò)80目篩，120℃干燥60 min，備用.

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取干燥至恒重的槲皮素對(duì)照品適量置50 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇配制成0.054 mg/mL的溶液，量取4.0 mL置于25 mL容量瓶中，加入5%三氯化鋁8.0 mL，無(wú)水乙醇定容，搖勻放置10 min.另取25 mL容量瓶，加入5%三氯化鋁8.0 mL，加無(wú)水乙醇定容，以此為空白，在波長(zhǎng)300～500 nm之間進(jìn)行掃描，確定槲皮素對(duì)照品的最大吸收波長(zhǎng)，以此波長(zhǎng)為測(cè)定波長(zhǎng).

精確稱取干燥至恒重的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品適量，用無(wú)水乙醇配制成0.054 mg/mL的槲皮素溶液，精取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 分置 25 mL 容量瓶中，各加入5%三氯化鋁的乙醇溶液8.0 mL，再加無(wú)水乙醇定容，搖勻放置10 min，另取一個(gè)25 mL容量瓶，加入5%三氯化鋁的乙醇溶液8.0 mL，用無(wú)水乙醇定容，以此為空白.在最大波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度.以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y=10.745x-0.005 7，R2=0.999 2，槲皮素濃度在0.004 8～0.057 6 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系.

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

3.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別稱取山楂樣品1.0 g置于帶冷凝管的圓底燒瓶中，分別改變果膠酶的用量、pH值、酶解時(shí)間、酶解溫度、料液比、乙醇濃度進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn).40℃超聲提取 2次，頻率為 40 kHz，時(shí)間為30 min.反應(yīng)結(jié)束后，離心分離沉淀，將上清液全部轉(zhuǎn)移置100 mL容量瓶中，加入無(wú)水乙醇溶液定容，作為待測(cè)樣品溶液.精密量取2 mL，置25 mL量瓶中，照2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項(xiàng)下的方法測(cè)定吸光度.對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，求黃酮提取含量.

3.1.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

由圖1～6可知，隨著酶量的增加總黃酮的提取量隨之增大，但酶量超過(guò)50 mg，隨著酶量的增加總黃酮提取含量反而下降，這是因?yàn)檫^(guò)量的果膠酶覆在山楂的表面阻礙黃酮進(jìn)入溶液中使提取量下降;當(dāng)pH為4時(shí)，果膠酶的活性最高，酸性較強(qiáng)時(shí)酶失活，酸性較弱時(shí)導(dǎo)致酶活性降低，而且隨著pH的增大溶出的雜質(zhì)也越來(lái)越多;隨著乙醇濃度的增大和用量的增加都會(huì)使總黃酮的提取量隨之增大，但一味的增多會(huì)導(dǎo)致提取液中雜質(zhì)含量增多，不利于進(jìn)一步的分離并且成本增加;隨著溫度的升高，山楂黃酮提取含量先升高后降低，因?yàn)閺臒崃W(xué)角度分析，溫度越高越有利于黃酮類化合物的溶出，但溫度過(guò)高時(shí)雜質(zhì)易溶出，且高溫會(huì)破壞黃酮化合物;隨著時(shí)間的延長(zhǎng)總黃酮的提取量隨之增大，1.5 h以后酶解作用較小，黃酮的提取量明顯下降.綜合以上分析，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)得到總黃酮的最佳提取條件為:果膠酶酶量為50 mg，70%乙醇溶液 40 mL，pH 為 4，50 ℃ 酶解1.5 h.

圖1 酶量與黃酮提取含量的關(guān)系

圖2 pH與黃酮提取含量的關(guān)系

圖3 乙醇濃度與黃酮提取含量的關(guān)系

圖4 料液比與黃酮提取含量的關(guān)系

圖5 酶解溫度與黃酮提取含量的關(guān)系

圖6 酶解時(shí)間與黃酮提取含量的關(guān)系

3.2 正交實(shí)驗(yàn)

3.2.1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

考察影響山楂總黃酮酶解提取工藝的主要因素為:酶量(A)，pH值(B)，酶解時(shí)間(C)，酶解溫度(D)，并采用紫外-可見(jiàn)分光光度法對(duì)提取物中總黃酮的提取量進(jìn)行測(cè)定，并以此為指標(biāo)進(jìn)行比較分析，故以 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，見(jiàn)表1.

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

3.2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

取山楂粉1.0 g置于帶冷凝管的圓底燒瓶中，加70%的乙醇溶液40 mL，按L9(34)正交表設(shè)計(jì)方案進(jìn)行試驗(yàn)，酶解后轉(zhuǎn)移至超聲儀中，溫度設(shè)為40℃，頻率為40 kHz，時(shí)間為30 min.反應(yīng)結(jié)束后，離心分離沉淀，取上清液于100 mL容量瓶中，無(wú)水乙醇定容，作為待測(cè)樣品溶液.精密量取2 mL于25 mL容量瓶中，照2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項(xiàng)下的方法測(cè)定吸光度.對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得黃酮提取含量，見(jiàn)表2.

表2 正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

綜合上表可知，RB＞RA＞RC＞RD，所以酶解法提取山楂中黃酮的影響因素B＞A＞C＞D，即影響因素的主次順序?yàn)橐掖紳舛龋噶浚附鈺r(shí)間，酶解溫度.比較k值的大小，可知討論所得的優(yōu)化條件組合為A3B2C2D2..

3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為進(jìn)一步考察優(yōu)選工藝的可靠性及穩(wěn)定性，取3份樣品按上述最佳提取工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果，見(jiàn)表3.

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

由表3的三次平行驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果知，山楂中總黃酮的平均提取量為 59.760 mg/g，表明該優(yōu)選工藝穩(wěn)定可行.

3.4 對(duì)比實(shí)驗(yàn)

在該實(shí)驗(yàn)相同實(shí)驗(yàn)條件下，分別利用超聲波法，索氏提取法對(duì)山楂總黃酮進(jìn)行提取，所得數(shù)值如下:

表4 不同提取方法的黃酮提取含量

由上述表格可知，與熱回流提取法及超聲波提取方法相比，酶解輔助提取法的提取含量比超聲波提取方法高21.40%，比索氏提取法的提取含量高53.51%.說(shuō)明采用酶解法協(xié)同超聲法提取山楂中的總黃酮確實(shí)可以提高總黃酮的提取量.

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)將果膠酶酶解法輔助超聲波提取法應(yīng)用于山楂果實(shí)中總黃酮的提取，對(duì)山楂中總黃酮提取工藝進(jìn)行了新領(lǐng)域的研究.利用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)討論了不同工藝條件對(duì)山楂中總黃酮提取含量的影響，優(yōu)化后的工藝條件如下:果膠酶用量為50 mg/g，50℃酶解1.5 h，70%乙醇溶液40 mL，酶解pH值為4，40℃超聲提取30 min，超聲頻率為40 KHz.在此條件下的總黃酮提取含量為5.98%.酶解法輔助超聲法比超聲波法的提取含量高21.40%，比索氏提取法的提取含量高53.51%.實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，采用果膠酶酶解法和超聲法兩種提取技術(shù)相結(jié)合提高了黃酮的提取量.

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