454高通量測序技術在土壤微生物中的應用

李 橋，王龍龍

（山東師范大學 人口·資源與環境學院，山東 濟南250014）

1 引言

土壤是一個非常復雜的生態環境體系，土壤微生物學作為微生物學的一個分支，一直在研究之中。土壤微生物是土壤的重要組成部分，是生態系統中重要的消費者和分解者，其群落結構多樣性及變化在一定程度上反映了土壤的質量和穩定性。土壤微生物多樣性是指微生物生命的豐富性及在遺傳、種類、生態系統層次上的變化，同時反映微生物群落的穩定性。許多研究已經證實，通過傳統的DNA分離方法測定出來的土壤微生物只占到環境微生物的0.1%～10%［1，2］。傳統的土壤微生物研究方法如微生物平板培養法、Biolog鑒定系統法、生物標記法等［3］往往會過低估價土壤微生物的群落結構組成，無法詳細描述出土壤微生物的群落結構組成方面的信息，也無法描繪出不同群體的生理差異。隨著科學技術的發展，傳統的Sanger技術的弊端也日益體現，一方面是因為該方法費時，且一次的反應數有限，另一方面是該技術基于酶法測序，成本較高。隨著微生物研究技術的迅速發展尤其是分子生物學技術的發展，土壤微生物學研究專家開發出一系列的研究土壤微生物群落結構的方法［4］，高通量測序技術也隨之誕生，慢慢應用到科研之中。

2 土壤微生物研究方法

2.1 微生物平板培養法

傳統的土壤生態系統中微生物群落多樣性及結構分析大多是將微生物進行分離培養，然后通過一般的生物化學性狀，或者特定的表現型來分析，局限于從固體培養基上分離微生物。這種方法只能培養出極少量的微生物類群，大約占0.1%～10%，無法對絕大多數土壤微生物的分類和群落結構進行深入研究。因此這種培養法局限性比較大，只能應用于特殊微生物的研究［5］。

2.2 BIOLOG鑒定系統

BIOLOG系統是Garland于1991年建立起來的一套用于研究土壤微生物群落結構和功能多樣性方法。細胞的維持和生長需要能量、碳源和多種無機離子，底物利用是群落中微生物存活和競爭的關鍵。因此可以根據微生物對碳源利用的方式來鑒定微生物的群落結構。碳數利用法通常用BIOLOG盤來實現。BIOLOG測試盤內有96個小孔，除了一個小孔為對照不含碳源外，其余都含不同的碳源。試驗中將碳源和指示劑一起放入平板小孔內，然后將稀釋后的細胞懸液接種到各個小孔中，由于微生物利用碳源引起指示劑變化，以此來檢測和判斷不同土壤微生物群落結構［6］。

2.3 分子生物學技術測序方法

在過去的20多年里，分子生物學技術尤其16S rDNA技術已經廣泛應用于鑒定未知菌類的研究中。20世紀80年代以來，逐步建立起了以分子系統發育分析為基礎的現代微生物分子生態學的研究方法，如PCR－RFLP、PCR－RAPD、PCR－SSCP、熒光原位雜交技術（FISH）、基因芯片（Microarry）、磷脂脂肪酸圖譜分析（Phospholipid fatty acid，PLFA）、穩定同位素探針（Stable Isotope Probing，SIP）、PCR－DGGE/TGGE等［7］，使得研究者能夠在分子水平上對土壤微生物多樣性進行研究。

但是這些技術只能在科或屬水平上分析土壤微生物的群落結構，不能更細致更詳細地對土壤微生物進行分析研究。隨著科學技術的發展，相繼出現了第一代、第二代、第三代高通量測序技術，使得研究人員能在種的水平上對土壤微生物進行研究和分析。

2.4 454高通量測序方法

高通量測序技術［8］是傳統測序一次革命性的改變，一次可以對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，在有些文獻中也稱其為下一代測序技術（next generation sequencing），可見其劃時代的改變，同時高通量測序使得對一個物種的轉錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序。

近年來，以16SrRNA/DNA為基礎的分子生物學技術已成為普遍接受的方法。研究表明，400～600堿基的序列足以對環境中微生物的多樣性和種群分類進行初步的估計［9］，因此454高通量測序的方法因其讀長（400～500bp）長和準確性高的特點大量用于微生物多樣性的研究。

因此通過高通量測序法來確定土壤微生物群落結構，從而可以在種的水平上將土壤微生物的群落結構分析出來，然后就可以對土壤微生物的多樣性進行分析。并可以對土壤微生物和鹽生植被的相互照應關系進行分析研究。

3 454高通量測序在土壤微生物研究中的應用

3.1 研究土壤微生物的物種多樣性

研究微生物物種多樣性主要從微生物類群即細菌、真菌和放線菌這三大類群的數目及其比例來描述某個地區某段深度土壤中微生物的多樣性，然后根據此地區土壤微生物物種的多樣性來探究全球范圍內土壤微生物的物種多樣性。通過高通量測序測得土壤中土壤微生物的各種菌類組成，以此來研究某個地區土壤中微生物的物種多樣性。

3.2 研究土壤微生物的功能多樣性

研究土壤微生物功能多樣性主要從各種微生物的活性及它們的相互作用產生的功能、底物代謝能力及與N、P、K等營養元素在土壤中相互轉化的功能等。通過將高通量測序得到的土壤微生物的群落結構及組成和實驗測定土壤的幾種理化性質及轉化過程來了解土壤微生物的功能。

通過實驗測得土壤的堿解氮、有效磷、活性有機質、腐殖質理化性質，可以分析地區土壤微生物的功能多樣性，以此來探究全球范圍內土壤微生物乃至整個微生物的功能多樣性。

3.3 研究環境的突然變化對土壤微生物菌群的影響

環境的突然改變會導致微生物群落的結構和功能發生變化。近幾年來隨著全球變暖，土壤微生物的群落結構可能發生了變化，地震、泥石流等自然災害也會對土壤微生物的群落構成產生影響。Zachary等以重水穩定同位素探測技術（H218O－SIP）鑒定與土壤增濕相關的細菌。先對土壤增濕前土壤微生物進行測定，得到土壤微生物各種組成，然后將土壤增濕后，對土壤中16SrRNA進行高通量測序，發現Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria的相對比例升高，而Chloroflexi和Deltaproteobacteria的比例則降低。作者通過控制土壤濕度的動態變化，對微生物菌群的結構發生變化進行研究，劃分生態類群。除此之外，溫度的驟變也會對土壤微生物菌群產生巨大的影響。

4 454高通量測序技術存在的問題及發展前景

到目前為止，大量的研究者應用454測序技術對多種環境樣品的微生物多樣性進行了深入研究，這些研究大大增長了人類對微生物的存在和種類的認識。針對不同的研究對象，454測序技術不僅為研究提供了大量數據，證實研究對象所含微生物具有較高的多樣性，而且還建立了一種研究復雜生態系統里的微生物多樣性方法。但由于該技術剛剛起步，所以存在一些待解決的問題。首先，隨著核酸序列數量上的跨越式累積，生物信息學分析將面臨巨大的挑戰。另外，海量數據的深入挖掘工作會發現用傳統生物學理論難以解釋的生命規律，對傳統理論的顛覆和新理論的提出與建立將成為不可避免的工作。

雖然存在許多不足，但454測序技術仍以其強大的測序能力滲透到生命科學研究的方方面面，包括那些此前無法用測序來解決的領域。在微生物領域，憑借著454測序技術各方面的優勢，終究會成為未來研究環境基因組的主導測序技術，同時，隨著454技術的不斷完善，該技術將為微生物生態學研究注入新的動力，成為微生物生態學研究新的亮點，大大加速微生物生態學的發展，增長人類對微生物生態學的認識，為人類探索廣袤的微生物資源提供無限遐想。

［1］Amann RI，Ludwig W，Schleifer KH.Phylogeneticidentification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation［J］.Microbiol.Rev.，1995，59（1）：143～169.

［2］Brock TD.The study of microorganisms in situ：progress and problems［J］.Symp.Soc.Gene Microbiol.，1987，41：1～17.

［3］Zhang X，L Z J ，Ch Z H.Soil microbial diversity research methods［J］.Journal of anhui agricultural sciences，2007，35（32）：10373～10375.

［4］Lu P，electronic leaching，W H Y，et al.Molecular biotechnology application in soil microbial diversity change［J］.Journal of clean coal technology，2009，15（6）：106～109.

［5］Huang Yanxia.Research progress on soil microbial diversity analysis technology［J］.Journal of anhui agricultural sciences，

［6］Ferris M J，Muyzer G，Ward D M.Denaturing gradient gel electrophoresis profiles of 16SrRNA defined populations inhabiting a hotspring microbial mat community［J］.Appl Environ Microbiol，1996，62：340～346

［7］Sultan M，Schulz M H，Richard H，et al.A global view of gene activity and alternative splicing by deep sequencing of the human transcriptome［J］.Science，2008，321（5891）：956～960.

［8］Schuster S C.Next－generation sequencing transforms today’sbiology［J］.Nat Methods，2008，5（1）：16～18.

［9］Chen Qiubo，LiuXiaoXiang.Climate change effects on soil microorganisms［J］.Journal of tropical agricultural sciences，2004，（1）：39～47.