水體中微囊藻毒素檢測技術研究進展

張從文，李紅梅，2，尤繼明，2，江 浩，2

（1.江蘇省寶應縣產品質量監督檢驗所，江蘇 寶應225800；2.江蘇省寶應縣國家有機食品質量監督檢驗中心，江蘇 寶應225800）

1 引言

我國各種水體富營養化十分嚴重。水體富營養化導致的藍藻水華，不僅破壞了健康、平衡的水生生態系統，而且因藻細胞破裂后釋放出微囊藻毒素（Microcystin，MC）［1～7］、節球藻毒素（Nodularia）、束絲藻毒素（Aphantoxin）等多種毒素而對飲用水的安全構成了嚴重的威脅［8～12］。

在所有藍藻毒素中MC是淡水中產生量最大、分布最廣泛和造成危害最嚴重的藻毒素類型。微囊藻毒素主要存在于微囊藻（Microcystis）、魚腥藻（Anabaena）、顫藻（Oscillatoria）和念珠藻（Nostoc）中，也有人從眠狀軟管藻（Hapalosiphon hibernicus）中分離到了MC。MC正常情況下存在于藍藻的細胞內，只有當細胞死亡或破裂后才會釋放到周圍水體中［8，9］。MC基本結構是由7個氨基酸組成的單環多肽，也稱7肽單環肝毒素，相對分子量在1000左右，由于多肽可變位置上氨基酸種類的變化，導致了MC的多樣性。目前已發現了60多種不同類型的MC。MC均含有一種特殊的3－氨基－9－甲氨基－2，6，8－三甲基－10－苯基－4，6－癸二烯酸 （Adda）。在天然水體中發現最多，檢出頻率最高，毒性較大的是MC－LR、RR和YR（L、R、Y分別代表亮氨酸、精氨酸和酪氨酸）。

目前，水中微囊藻毒素檢測方法很多，大致分為三類：①化學法，包括薄層層析法（TLC），液相色譜法（LC）［13～16］，液質聯用法（HPLC－MS）［17～19］，毛細管電泳法（CE）等；②生物法，包括生物體法，酶抑制－蛋白磷酸酶PP1／PP2A法；③免疫化學法，包括放射免疫法（RIA），間接競爭酶聯免疫法（idc－ELISA），直接競爭酶聯免疫法（dc－ELISA），夾心免疫法（Sandwich－ELISA）。

2 化學法

2.1 薄層層析法（TLC）

薄層層析法是將固定相（如硅膠）薄薄地均勻涂敷在底板（或棒）上，試樣點在薄層一端，在展開罐內展開，由于各組分在薄層上的移動距離不同，形成互相分離的斑點，測定各斑點的位置及其密度就可以完成對試樣的定性、定量分析的色譜法。

2.2 液相色譜法（LC）

高效液相色譜具有高壓、高速、高效、高靈敏度、應用范圍廣，更適宜于分離、分析高沸點、熱穩定性差、有生理活性及相對分子量比較大的物質，因而廣泛應用于各種分析檢測中。吳偉文［13］等采用固相微萃取與高效液相色譜法聯用技術分析了水溶液中痕量的微囊藻毒素，該方法測定MC－LR（LR型微囊藻毒素）的線性范圍為1.00～200μg／L，相關系數為0.999 5，檢出限為0.45μg／L，相對標準偏差（RSD）為2.4%，回收率為90%～99%。該方法測定MC－RR（RR型微囊藻毒素）的線性范圍為1.00～100μg／L，相 關系數為 0.9988，檢 出限為 0.15μg／L，RSD為2.4%，回收率為89%～100%。

郭堅［14］等建立了一種全自動化在線固相萃取－高效液相色譜法快速、準確測定水體中3種痕量微囊藻毒素的新方法。樣品用自動進樣器連續注入固相萃取小柱完成富集后，通過雙梯度高效液相系統中的一個泵（上樣泵）實現凈化，再通過閥切換將固相萃取小柱切換至分析流路中，用另一個泵（分析泵）將待測物沖洗至分析柱進行測定。檢測波長為238nm，進樣體積為10mL，整個分析時間為20min。方法在0.5～10μg／L范圍線性良好，3種微囊藻毒素的線性相關系數R2＞0.9996，檢出限為0.1μg／L（S／N＞3），6次平行測定峰面積RSD＜1.6%，方法可有效應用于水體中痕量微囊藻毒素的測定。

戚莉莉［15］等建立了有效準確的檢測方法：流動相體積分數：35%乙腈＋65%水；體積流量：0.8～1.0 mL／min；紫外檢測波長239nm；進樣量10μL；在該條件下，以HPLC測定MC的檢測限值為0.1mg／L。并應用該法分析了2007年太湖藍藻爆發期間的水樣，結果表明方法具有實用性。

張立將［16］等選用甲醇－0.05%三氟乙酸水溶液作為流動相進行梯度洗脫，對MC－RR和MC－LR取得較好分離效果，水樣檢出限可達0.02μg／L。優化后的前處理、檢測方法，對 MC－RR，MC－LR平均回收率分別為88.9%，并且優化了前處理方法－冰乙酸處理法。

2.3 液質聯用法（HPLC－MS）

液相色譜－質譜聯用技術，它以液相色譜作為分離系統，質譜為檢測系統。樣品在質譜部分和流動相分離，被離子化后，經質譜的質量分析器將離子碎片按質量數分開，經檢測器得到質譜圖。液質聯用體現了色譜和質譜優勢的互補，將色譜對復雜樣品的高分離能力，與MS具有高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對分子質量與結構信息的優點結合起來，在藥物分析、食品分析和環境分析等許多領域得到了廣泛的應用。

王蕾［17］等以實驗室培養銅綠微囊藻為原料，建立了固相萃取富集微囊藻毒素，液相色譜－電噴霧電離質譜測定藻樣中的微囊藻毒素 MC－LR的方法。該法絕對檢出限為25pg，回收率為70%以上，方法靈敏度高，實用性強。

王超［18］等利用固相萃取富集和凈化，經LC分離后，采用DAD和IT MS定性分析，DAD定量分析。在優化的條件下，水中5種微囊藻毒素的檢出限為0.1μg／L；3個質量濃度加標水平（0.2、0.8和5μg／L）的平均回收率為52.2%～115.2%，相對標準偏差為1.2%～10.0%。

虞銳鵬［19］等通過固相萃取富集微囊藻毒素，并采用液相色譜－電噴霧電離質譜測定水中的微囊藻毒素－RR，－LR。分別在 m／z為520.4、996.3時，采用選擇離子掃描方式，提高檢測靈敏度。該法檢出限為0.01μg／L；線性定量范圍為0.02～20μg／L。該方法靈敏度高，實用性強，可為水質藻毒素風險評價和監測水處理脫毒效能，提供靈敏、準確的分析方法。

化學分析法不僅能定量精確的檢測 MCs，可對不同的MC作精確定性定量測定，運用恰當可測到各組分的μg／L級的含量。但是由于化學分析方法需要復雜的前處理過程，并且所需的儀器價格昂貴，限制了它的實際應用。近年來，隨著新的萃取技術的出現，固相微萃取技術（SPME）、基質固相分散萃取技術（MSPDE）和免疫吸附萃取技術（IE）等也應用于MCs檢測的前處理中。這些技術高效、快速、節省時間，耗費有機溶劑極少甚至不用溶劑，提高了樣品中MCs的提取率，保證了檢測數據的準確性。

3 生物法

生物分析法用動物急性毒性實驗間接推算MC的含量，結果較為直觀、快速，但無法用于準確定量測定。蛋白磷酸酶法利用MC能夠抑制蛋白磷酸酶PP1和PP2A活性的特點，以磷酸化蛋白為底物，測定MCs對蛋白磷酸化酶的抑制程度，即測定MCs、磷酸化蛋白、蛋白磷酸化酶反應后釋放的磷酸鹽的量來檢測微囊藻毒素的量。蛋白磷酸酶法可以反映各種毒素的總量、檢測靈敏度高而且測定時間較短，在用于環境監測時具有優勢。但蛋白磷酸酶法的檢測限度是pg級，低于WHO標準，酶反應體系中的很多變量尚未進行量化和建立一個統一的標準，方法選擇性較差，對于各種MCs的靈敏度不同，只能測定毒素總量，無法分別測定不同種類毒素的量，也不能夠區分微囊藻毒素和其他的蛋白磷酸酶抑制劑，測定的是MCs的總量，如果藍藻本身具有內源蛋白磷酸酶活性，則有可能使PP1的結果偏低。此外，蛋白磷酸酶價格很昂貴，若自己制備則對設備和操作人員的要求非常高［20］。

4 免疫化學法

免疫檢測方法的原理是利用微囊藻毒素誘發免疫反應產生抗體，利用抗體對抗原的特異性識別來對各種毒素進行檢測。樣品處理簡單，便于操作，被國內外同行廣泛接受。近年來，免疫檢測方法已發展出多種單克隆抗體和多克隆抗體，用這兩種抗體制成的MCs酶聯免疫測試試劑盒已商品化。但是由于這些試劑盒所用抗體一般是針對MC－LR設計，使得它對于MCs其他異構體交叉反應性低，因此試劑盒對于許多天然存在的MCs靈敏度差異較大，不能檢測所有的毒素。而且酶聯免疫法假陽性出現幾率大，重現性差［21］。

5 問題與展望

在所有分析微囊藻毒素的檢測方法中色譜法結果穩定可靠，操作簡單，是目前應用最多的方法，有廣闊地發展前景。但是如何檢測毒素國家尚未有一個標準方法，而且，天然水體中通常微囊藻毒素的濃度較低，因此，研究和發展低濃度藻毒素的分析鑒定方法以對其進行監測十分重要。

通過研究不同介質中痕量MC的提取、富集方法，優化樣品的前處理過程，利用高效、高靈敏的聯用技術和多殘留組分確證技術分析MC－RR、LR和YR，并且在此基礎上努力研究發展一些簡單、快速和便攜化的篩選多殘留分析技術將有助于水源受富營養化污染的城市之供水部門發展新的水質監測分析技術，控制供水水質，保障人民的安全與健康。

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