藥物靶點篩選的研究

崔大明

長春中醫藥大學，吉林長春 130117

20世紀90年代，隨著生命科學的發展和生物技術的進步, 基于靶點的藥物發現模式逐漸取代了傳統的基于藥物化學結構的發現模式，成為現代創新藥物研發的主流模式。本文主要總結了藥物靶點篩選的全部流程，并重點介紹了靶點確認及驗證的成熟方法。

1 藥物靶點篩選的三個階段

1.1 小分子藥物的篩選

藥物靶點的篩選首先要篩選感興趣的藥物，主要有兩種基本方式：基于靶點的篩選和表型篩選。

1.1.1 基于靶點的篩選 到目前為止，很多藥物都是通過這種方法篩選得到的，基于靶點的篩選可以有效的篩選到具有生物活性的小分子物質，這種篩選方式定位于特定的靶蛋白，例如，激酶，組蛋白去乙?；富蛘呤荊蛋白偶聯受體。通過此方法篩選得到的小分子活性物質對靶點的具有強烈的影響作用，但是，在有機體內，它可能影響多種蛋白及信號通路而不僅僅是一個靶點或通路。在活體內，一種蛋白的功能通過與另一種蛋白的相互作用而發揮，同樣的，小分子物質因為其化學性質及與細胞內信號機制的固有連通性，因而具有多個靶點。所以，要想明確了解某個已選定的小分子物質的活性，需要一個更綜合的行篩選方法例如表型篩選法。

1.1.2 表型篩選法 表型篩選法是一種綜合性的篩選方法，可以在細胞或者是生物體水平上評估某個小分子物質的生物活性。

血管新生篩選包括細胞入侵和人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）形成血管，當用血管內皮細胞生長因子或者低氧的環境處理時，人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）侵入到基質中重建新的血管，而人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）也可以形成管狀結構來穩定新生的血管。如果某個小分子物質抑制以上兩種現象且同樣抑制人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）的生長，那此物質就是一種潛在的血管生長抑制劑。

自噬篩選包括對增多的自噬體的檢測[5]，通過酸性胞液染色標記可以很容易的檢測到自噬體的存在，高內涵篩選（HCS）可以量化活細胞內自噬體的數目。此外，細胞的形態學特征，生長狀況及死亡情況都可以很容易的檢測到，自噬可以作為治療癌癥及動脈粥樣硬化的潛在靶點。自噬電離劑（Autophagonizer），是近幾年通過表型篩選及后期的高內涵篩選（HCS）得到的一種誘導細胞自我吞噬的小分子物質，且它不會被部分已知的自噬抑制劑所抑制，它的作用機制似乎與雷帕霉素有所不同，雷帕霉素是通過抑制雷帕霉素靶蛋白誘導細胞的自我吞噬，但是其作用靶點還有待研究。

表型篩選相對于傳統的基于靶點篩選具有以下幾點優勢：①表型篩選是對全基因組的篩選，覆蓋了所有與所篩選表型有關的靶點及信號通路[6]。②表型篩選是在有機體及細胞水平下進行的，吸收，分配，代謝，排泄因素都考慮在內，但是經此方法篩選后，對于藥物作用的靶點及通路是不明確的，需要后期進一步的識別和驗證。③與傳統的基于靶點的篩選相比，它不需要預先的假設及分析，這種篩選非常適合對機制不明的疾病的靶點的篩選。

2 靶點驗證

多種靶點識別方法得到的藥物作用靶點只能作為靶點初步篩選的方法，之后需要對候選靶點進行驗證。第一步就是確認此靶點在細胞實驗中是否調節化合物的生物活性?？梢酝ㄟ^RNA干擾技術沉默某一疾病的基因，形成缺乏特定靶標的小鼠，看它是否具有普通小鼠藥物作用后的癥狀，或者將藥物注射到基因敲出的小鼠中，若藥物沒有引起效應，說明藥物是通過這一特定靶點作用的，因為候選靶點的同系物也要被納入考慮范圍即使其在最初的篩選中并沒有被識別，此外，一個物質可能具有功能性獲得的活性，靶點的缺失會抑制此物質的活性[15]。除了RNA干擾技術，也可以用cDNA過表達來建立藥物-靶點作用關系，這種方法類似于酵母中的拷貝數抑制現象，靶點的過表達可能會抑制藥物的活性。這種方法對于驗證膜靶點極為重要。

一旦假定的靶點通過功能實驗的驗證，就需要對小分子物質及靶點的親和力進行量化。這一過程可以通過表面等離子共振或者等溫量熱法技術完成，如果假定的靶點是一種酶，則要通過酶動力學實驗衡量此物質的酶活力[16-17]。最后，需要通過NMR或共結晶實驗進行更為嚴格的驗證，進而得到藥物-靶點復合物的三維結構。這些信息不僅可以驗證物理上的關聯性，也可以提供后期藥物優化中結合模型的鑒定標準。

3 結語

與傳統的基于靶點的篩選方法相比，表型篩選是一種篩選具有高潛力藥物靶點的快速有效方法。表型篩選是對全基因組的篩選，覆蓋了所有與所篩選表型有關的靶點及信號通路，吸收，分配，代謝，排泄因素都考慮在內。這種篩選非常適合對機制不明的疾病的靶點的篩選。此方法篩選后，對于藥物作用的靶點及通路依然是不明確的，需要經過后期對靶點的識別和驗證。

經過表型篩選后，需要通過表型篩選呈陽性的物質識別細胞內的靶點，目前已經有多種成熟的技術方法用于靶點的識別，也不斷有新的方法被廣大研究人員發現，并取得了較好的效果，隨著各項檢測技術的發展，這些方法也在不斷完善中，相信在不久的將來會有一套完整的靶點識別方法。

靶點識別得到的候選靶點并不一定就是目標靶點，其中可能混有假陽性結果，靶點驗證就是對候選靶點的進一步篩選過程，并最終得到藥物-靶點結合復合物的三維結構，這種結構對后期的藥物優化工作具有很大的幫助。

藥物靶點研究將對藥物的發現和開發具有極其重要的促進作用，人們對藥物靶點的研究將長期進行。隨著對藥物靶點認識的不斷提高，技術方法不斷成熟，新的藥物靶點將不斷發現，具有新型作用靶點、治療疾病效果更好的藥物也將不斷出現。

[1] MATTER A.Tumor angiogenesis as a therapeu tic target[J].Drug D iscov T od ay，2001，6（19）：1005-1024.

[2] Cheung AK，Jain RK.Accelerating the discovery of new drug targets with chemical proteomics[J].IDrugs，2010，13：862-868.

[3] Zhou HX，Rivas G，Minton AP.Macromolecular crowding and confinement：biochemical，biophysical，and potential physiological consequences[J].Annu Rev Biophys，2008，37：375-397.

[4] Mallick P，Kuster B.Proteomics: a pragmatic perspective[J].Nat Biotechnol，2010，28：695-709.

[5] Cho，Y.S.；Kwon，H.J.Control of autophagy with small molecules Arch[J].Pharm.Res，2010，33：1881

[6] Matthias A，Cord D.Phenotype-first screening for the identification of novel drug targets[J].Drug Discovery Today：Targets，2005，4.

[7] Giaever G，Chu AM，Ni L，Connelly C，Riles L，et al.Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome[J].Nature，2002，418（6896）：387–391.

[8] Feng Cong，Atwood K.Cheung，Shih-Min A.Chemical Genetics–Based Target Identification in Drug Discovery[J].Annu. Rev.Pharmacol.Toxicol，2012，52：57–78.