良性膽管狹窄形成機制的研究進展

黃峻松綜述，李光早審校

良性膽管狹窄是指各種非腫瘤性因素導致膽管纖維組織增生、瘢痕攣縮，形成的膽管纖維性狹窄。狹窄部位可發生于肝內及肝外膽管，可單發亦可多發。目前針對良性膽管狹窄所采取的手術修復，效果較差，術后再狹窄發生率高［1］，近年來，隨著基因與分子生物學等的發展，一些基因表達產物及細胞因子介導的信號傳導在瘢痕組織所起的作用不斷被揭示，進而應用到良性膽管狹窄中。現就良性膽管狹窄形成機制的進展作一綜述。

1 肌成纖維細胞

傷口的愈合均伴隨著瘢痕的形成，沒有瘢痕傷口就不能愈合，瘢痕是傷口愈合必然經歷的一個過程［2］。瘢痕部位膠原的過量沉積導致瘢痕過度增生［3］。膽道瘢痕性攣縮和管腔狹窄是良性膽管狹窄突出表現。馬曉等［4］通過制作家兔膽總管損傷修復模型，發現膽管愈合方式屬于過度愈合，愈合時間延長，膽管黏膜上皮修復較差，慢性炎癥持續存在，成纖維細胞增生活躍，愈合后黏膜下膠原纖維過度沉積，改建較差，結果導致瘢痕增生，吻合口狹窄發生率較高。近年來，人們逐漸認識到肌成纖維細胞(MFB)與瘢痕攣縮關系密切［5］，其特征介于平滑肌細胞和成纖維細胞之間。正常情況下，MFB 通過細胞凋亡而死亡、消失，而在增生性瘢痕和纖維化疾病中持續存在［6］。有研究表明巨噬細胞及轉化生長因子(TGF-β1)的高表達與膽道瘢痕增生有密切關系［7］。其原因可能與管壁慢性炎癥有關。炎性反應持續存在造成上皮愈合后巨噬細胞仍大量聚集，持續合成、分泌多肽生長因子，導致成纖維細胞增殖旺盛，膠原過度合成，管腔瘢痕性狹窄。耿智敏等［8］在制作犬肝外膽管損傷修復模型中觀察到膽管瘢痕組織存在大量肌成纖維細胞。細胞功能活躍，細胞質內有發達的粗面內質網、高爾基復合體，靠近細胞膜處有發育良好的微絲和密體，核卷曲不規則，從而提供了細胞收縮的證據。MFB 術后1 周時開始出現，3 個月時達到高峰，高峰期持續較長一段時間。細胞的生活周期與肉芽組織的增生收縮過程基本一致。

2 血小板衍化生長因子

血小板衍化生長因子(PDGF)是一種與損傷修復有關的生長因子，在損傷修復中可以不同的方式產生。PDGF 生物學特性包括:①促分裂效應，PDGF 刺激血管平滑肌細胞、成纖維細胞、膠質細胞的分裂增生;②趨化活性，對中性粒細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞有趨化性;③參與細胞凋亡、轉化過程的調控。PDGF 對成纖維細胞、平滑肌細胞、中性粒細胞、單核細胞等有趨化作用，并刺激成纖維細胞增殖及誘導其合成膠原、纖維連接蛋白和細胞外基質等成分，以形成肉芽組織，促進創面愈合。創傷后釋放的PDGF 是單核細胞和成纖維細胞(FB)的黏附趨化劑，并促進其增殖，激活巨噬細胞誘導FB 產生膠原蛋白和纖維連接蛋白，并使膠原酶活化，調節細胞外基質的更新。FB 在過度增生炎性組織中的化學趨化和促進有絲分裂的反應明顯高于炎性組織，可能與細胞表面PDGF 受體水平不同有關。Ladin 等［9］在病理性瘢痕組織里培養FB，PDGF 蛋白的表達升高。創傷后釋放的PDGF 是單核細胞和FB 的黏附趨化劑，并促進其增殖，激活巨噬細胞誘導FB 產生膠原蛋白和纖維連接蛋白，并使膠原酶活化，調節細胞外基質的更新。PDGF 表達與多種生長因子在調控創面修復方面有相互影響的作用，它們相互協調控制，共同作用影響組織的修復增生［10-11］。陳衛明等［12］研究表明，PDGF 在肝內、外膽管瘢痕組織的膽管上皮細胞、增生的FB、血管內皮細胞及一些炎癥細胞中均有強陽性表達。主要定位于細胞膜和細胞質表達。正常膽管組表達較弱，甚至無表達。說明PDGF 與膽管瘢痕形成有著密切的關系。

3 結締組織生長因子

結締組織生長因子(CTGF)是富含半胱氨酸的分泌型肝磷脂結合蛋白［13］，屬即刻早反應基因(CCN)家族一員，它是一種新發現的促成纖維細胞分裂和膠原沉積的生長因子。正常情況下，結締組織生長因子信使核糖核酸(CTGF mRNA)在心臟、肺、胎盤、肝、肌肉及腎臟等臟器中均有表達，其生物效應包括促進細胞肥大、黏附、增生、分化、遷移、血管形成和凋亡，參與胚胎發育、胎盤形成、腫瘤形成等。在機體損傷和纖維化時，CTGF 高表達并作為TGF-β1的下游元件，介導TGF-β1、血管內皮生長因子、脂質過氧化物等多種信號刺激的促纖維化作用，促進包括肝星狀細胞(HSC)在內的多種纖維活性細胞因子合成并分泌細胞外基質［14-15］，而TGF-β1對CTGF 的產生有明顯調控作用。體外培養的人增生性瘢痕成纖維細胞與正常皮膚的相比較，膠原合成、CTGF 及CTGF 基因表達均顯著增高。這些均表明在瘢痕疙瘩、增生性瘢痕纖維化進程中CTGF 發揮了重要作用，隨著CTGF DNA 向CTGF mRNA 的高水平轉錄，大量的CTGF 蛋白被合成，從而刺激成纖維細胞的增殖及膠原沉積，通過自分泌、旁分泌作用，增殖的成纖維細胞又會產生更多的CTGF，形成正向反饋，最終形成大量纖維組織。目前的研究認為，CTGF 的致纖維化作用可能是依賴Ras/細胞外調節激酶活化激酶(MEK)/細胞外調節激酶(ERK)和Smad 信號途徑介導的［16］。最近研究發現CTGF與膽管纖維化程度呈正相關，耿智敏等［17］對23 例良性膽管狹窄的病例進行研究發現，CTGF、CTGF mRNA 在良性狹窄膽管組織中的陽性率分別為82.6%和65.2%;而在正常膽管組織中的陽性率分別為50.0%和16.7%，兩組間差異具有統計學意義(P ＜0.05)。既往的研究發現，人良性狹窄膽管組織中可檢測到TGF-β1及其受體高表達于肉芽組織、成纖維細胞、巨噬細胞及血管內皮細胞，說明CTGF 作為TGF-β1的下游效應遞質，在術后狹窄膽管組織中呈高表達，介導TGF-β1的致纖維化生物學作用。這提示在膽管組織瘢痕增生、良性狹窄形成過程中，被激活的成纖維細胞和增殖的內皮細胞表達TGF-β1，進一步生成更多的CTGF，繼而刺激成纖維細胞合成膠原和其他細胞外基質，抑制膠原蛋白分解，增加新生小血管，誘導創傷修復。TGF-β1和CTGF 的高表達，擾亂了膠原合成與降解的平衡，刺激成纖維細胞產生膠原及其基質成分并沉積，導致瘢痕增生，最終導致膽管狹窄形成。

4 IL-6/gp130/STAT3 傳導通路

白介素-6(IL-6)/糖蛋白130(gp130)/信號轉導因子和轉錄活化因子3(STAT3)是具有多重生物學效應的細胞信號傳導系統，它在不同的組織及細胞中發揮著不同的作用。IL-6 通過受體作用于細胞表面IL-6 受體(IL-6R)，該受體含有兩個亞基:IL-6Rα和IL-6Rβ，二者均是Ⅱ型膜糖蛋白分子。IL-6 與IL-6Rα 結合后識別gp130，形成由兩分子IL-6、兩分子IL-6Rα、兩分子gp130 構成的六聚體，該六聚體可激活胞漿區Janus 激酶2(JaK2)酪蛋白激酶，后者通過誘導STAT3 的酪氨酸殘基磷酸化而激活STAT3，并與STAT1 蛋白或另一個STAT3 蛋白的Src 同源結構域2(SH2)功能區識別并結合，形成穩定的同源或異源二聚體，暴露它的核定位區，易位到核內，結合到不同靶基因的啟動子區而啟動轉錄，誘導基因表達，調控細胞的活化、增殖、分化、存活、凋亡抑制及惡性轉化［18］。正常的膽管上皮細胞內通常不表達或低表達白介素-6 信使核糖核酸(IL-6 mRNA)，但膽管損傷后(如感染、膽管梗阻、膽汁淤積及免疫損傷等)可以促進增殖的膽管上皮細胞和其周圍的淋巴細胞釋放IL-6 mRNA 及蛋白［19］，因而改變膽管上皮細胞的微環境，從而在損傷的膽管上皮細胞內產生IL-6/STAT3 信號通路的自分泌、旁分泌作用，致使該通路持續活化。此外，非新生的膽管上皮細胞在其他炎癥因子作用下，如IL-1β、TNF2α，也能合成IL-6，成為膽管上皮細胞在應激或損傷狀態下的自分泌生長因子［20］。肝移植術過程的冷保存-再灌注也是造成膽管上皮細胞損傷的因素之一，也是引起膽管非吻合口性狹窄的常見原因。Demetris 等［19］通過應用免疫印跡及免疫組織化學技術檢測肝移植術后肝組織中STAT3 的含量發現，IL-6+/+的小鼠肝組織中IL-6/gp130/STAT3 信號傳導途徑處于活化狀態，而IL-6-/-者則處于失活狀態，說明IL-6/STAT3 作為調控細胞增殖的重要信號通路，可能是介導肝移植后膽管上皮細胞增殖的分子機制之一。陳莉萍等［21］應用免疫組化技術對200 只小鼠進行研究發現，肝移植術后組肝內炎癥反應強而持久，膽管樹周圍肝組織IL-6 mRNA 含量處于較高水平，STAT3 活化程度及肝內膽管上皮細胞增生情況均顯著高于只進行開腹手術的對照組(P ＜0.05)，這提示膽管損傷后膽管上皮細胞的增生存在IL-6/gp130 傳導通路的激活，STAT3 的活化可能來自于IL-6 的刺激，且活化程度與IL-6 mRNA表達水平呈正相關。

5 Smad 蛋白

TGF-β1是目前公認的與瘢痕形成關系最密切、最具代表性的生長因子［22］。TGF-β1的生物學效應是通過特定的信號轉導途徑調控，其中Smad 是該路徑中的關鍵蛋白，被稱為TGF-β 信號跨細胞轉導的重要換能器，它是TGF-β1受體后信號分子，參與對細胞增殖、轉化、合成、分泌和凋亡的調控。根據Smad 蛋白在TGF-β1轉導通路中結構和功能特點的不同，可分為3 類［23］:①受體激活型Smad，主要有Smad 1、2、3、5、8，它們是TβR 復合物的下游信號分子，其中Smad 2、3 主要介導TGF-β1和生物素的信號;②共同通路型Smad，是TGF-β1必需的信號轉導分子，目前在哺乳動物發現的有Smad 4;③抑制性Smad，主要有Smad 6、7，抑制其他兩類Smad 的活性。TGF-β1/Smad 信號傳導通路通過正、負反饋調節環路進行調控的，Smad 4/Smad 7 分別是兩個環路中的重要因子。TGF-β1可通過Ⅰ、Ⅱ型受體、Smad 通路傳遞并放大信號，由磷酸化的Smad 激活核內TGF-β1啟動子，誘導內源性TGF-β1的表達，形成正反饋調節環路;同時，磷酸化的Smad 激活抑制性因子Smad 7 的啟動子，瞬時上調Smad 7 表達;磷酸化的Smad 2 和磷酸化的Smad 3 還作用于自身的基因啟動子區抑制基因的轉錄，下調細胞中受體調節型Smad(R-Smad)的水平，抑制自身的信號傳遞。于是，TGF-β1通過激活Smad 7 和下調R-Smad的表達形成負反饋調節環路從而抑制自身的信號傳導。耿智敏等［24］應用免疫組化等方法對23 例良性膽管狹窄的研究顯示，Smad 4 在良性膽管狹窄組織中陽性率為78.3%，而在正常膽管組織中為33.3%，在狹窄膽管組的陽性率明顯高于正常膽管組(P ＜0.05)。此實驗說明Smad 蛋白與良性膽管狹窄形成有著密切關系，TGF-β1水平增高通過正反饋途徑增強自身及受體的表達，使生物活性放大，引起Smad 4 高表達，同時上調的Smad 7 發揮不了有效的拮抗作用，使成纖維細胞活躍，擾亂了膠原合成與降解平衡，大量的膠原及其基質成分沉積，導致瘢痕增生，最終狹窄形成。

6 原癌基因蛋白C-MYC 和C-FOS

早期基因C-MYC 和直接早期基因C-FOS 均屬于核內結合蛋白類癌基因，是細胞內信息傳遞的終端，它們的產物核蛋白(C-MYC、C-FOS)主要分布于基底層細胞、血管內皮細胞及成纖維細胞等功能活躍的細胞，對調節轉錄水平及介導細胞由靜止期向增殖期轉化并在傷口愈合中起重要作用。C-MYC與C-FOS 在增生性瘢痕的成纖維細胞中可被持續存在的較高水平的TGF-β1所激活，C-MYC 原癌基因活化后，可以促進細胞由靜止期(G0 期)進入分裂期(S 期)，促進細胞的分裂增殖。C-MYC 原癌基因表達的蛋白定位于核內，與某些癌基因協調轉化細胞，最終使細胞進入S 期。C-MYC 基因參與了此過程并起重要作用，尤其是細胞從G0 期進入G1 期的過程。C-MYC 原癌基因表達是細胞有絲分裂的中介物，它可與多種生長因子在調控創面修復方面相互影響，相互協調，共同作用影響組織的修復增生［25-26］。C-FOS 基因在成纖維細胞、成肌細胞、造血細胞等多種細胞的增殖和分化中起重要的作用。在正常的膽管組織中，C-FOS 基因僅呈極低水平表達，但在膽管組織的炎癥、局部低氧及膽汁中的膽鹽、卵磷脂或返流的腸液等各種因素的刺激下，C-FOS 能迅速表達，其編碼的細胞核磷酸蛋白具有DNA 結合活性，被看做是細胞核內的“第三信使”。C-FOS 能使細胞由G0 期啟動而進入細胞周期。在細胞周期中，細胞周期蛋白與相應的細胞周期依賴蛋白激酶結合，經磷酸化/脫磷酸化修飾后具有活性，促使與周期有關的蛋白基因表達，從而控制細胞周期的進程，促進膽管組織中成纖維細胞等的增殖與合成。此外C-MYC 與C-FOS 蛋白表達的細胞定位、陽性信號形態及強度較為相似，說明兩者在促進瘢痕形成的過程中具有相互協同的作用，參與了成纖維細胞的增殖和功能調控以及膠原合成與降解，從而導致異常瘢痕的增生。張小文等［27］應用免疫組織化學等方法對12 例肝內膽管狹窄及8 例肝外膽管狹窄組織中C-MYC、C-FOS 基因表達程度的研究發現，肝內、外膽管瘢痕組織中C-MYC、C-FOS 基因表達均較高，而在正常膽管組織表達較弱，甚至無表達，經兩兩比較，肝內、外膽管瘢痕組間差異無統計學意義(P ＞0.05)，而兩組與對照組比較差異有統計學意義(P ＜0.01)，說明原癌基因C-MYC 和CFOS 與膽管瘢痕形成有密切的關系。

7 人類細胞同源Fas 相關死亡域樣白介素1β 轉化酶樣抑制蛋白

Fas 相關死亡域樣白介素1β 轉化酶(FLICE)樣抑制蛋白(c-FLIP)是表達于多種腫瘤細胞中的重要的抗凋亡蛋白之一［28］，其串聯結構中含有兩個死亡效應域，可通過競爭性結合某些凋亡受體的死亡域結構如Fas 相關死亡域(FADD)和腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體，導致天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶-8(caspase-8)前體激活受阻，從而引起凋亡失敗。目前所知的FLIP 家族包括病毒FLIP(v-FLIP)和細胞內FLIP(c-FLIP)。后者包括長鏈c-FLIP(c-FLIPL)、短鏈c-FLIP(c-FLIPS)和c-FLIPR 等3 種蛋白表達。其中，c-FLIPL 的氨基酸碳末端含有兩個串聯的死亡效應域(DED)，其后連接有一個類caspase 域。兩個DED 可使FLIP 偶聯調節分子FADD 或者caspase-8、caspase-10 前體，從而阻斷凋亡［29］。何貴金等［30］通過多聚寡核苷酸原位探針雜交的檢測方法發現，c-FLIP 基因mRNA 在膽管損傷修復的各個時間段均呈明顯陽性表達，主要定位于成纖維細胞及炎癥細胞，而假手術組很少表達。說明膽管愈合實際是一個正常凋亡受抑制的過程，以纖維修復為主，而炎性細胞的表達或許與膽管環境下的慢性炎癥刺激有關。同時也發現，c-FLIP 在淋巴細胞、單核巨噬細胞以血管內皮細胞中有程度不等的表達。這些炎癥免疫細胞將直接參與炎癥過程并不斷釋放大量炎癥介質及細胞因子，c-FLIP 的表達將造成這些炎癥細胞的凋亡減少，增殖加速，進而釋放更多炎癥因子促進炎癥的持續進行，于是反過來又將持續性激活c-FLIP 上游核因子kappa B(NFκB)引起更多的c-FLIP 表達，這是一個正反饋的過程，或許也是造成膽管成纖維細胞大量增殖的原因之一。

綜上所述，良性膽管狹窄的形成是一個極其復雜的過程，可能涉及多種基因表達產物和多種信號傳導途徑因素的參與，而這些因素之間可能存在交叉交互作用。目前對良性膽管狹窄形成機制只是初步了解，暫沒有一個整體觀念。要真正闡明其發病機制及發展過程，進而為膽管狹窄的早期診斷及有效防治提供理論依據，需要基礎和臨床工作者做更多的工作。

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