NASH的免疫學發病機制研究現狀*

魏艷玲 陳東風

非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）的概念于1980年由Ludwid等人首先提出，發現這類病人的肝組織學改變與酒精性肝炎（ALD）相似，但沒有過量飲酒史。肝臟病理學改變表現為肝細胞大泡性脂肪變性，小葉內炎癥伴點狀壞死，肝細胞氣球樣變，并可出現Malloy小體等[1]。最初，NASH被認為是僅發生于肥胖女性的一種良性病變，未能引起人們的足夠重視。然而，隨著對NASH的深入研究，發現NASH是非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的一種病理類型。實際上，NASH只是NAFLD病程發展的一個階段，被認為是隱源性肝硬化的原因之一[2]。NAFLD可以是一個獨立的疾病，但更多見的還是全身性疾患在肝臟的一種病理過程，隨病程的進展其疾病譜表現不一，包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纖維化和肝硬化。有的研究甚至認為NASH是一種癌前期病變[3]。當前，NASH已成為僅次于慢性病毒性肝炎和酒精性肝病之外重要的肝硬化前期病變之一，并為健康體檢人群肝功能酶學異常的常見病因，NASH的有效防治可望阻止慢性肝病進展，減少肝硬化和肝病相關死亡的發生率。

NASH的發病機制至今仍不明確。盡管現今發現糖尿病、高脂血癥與其發病有著密切的相關性，但具體在發病中的作用還甚不清楚[4]。多數學者認為NASH的發病機制是在肝臟脂肪變性基礎上，以線粒體反應氧體系（reactive oxygen species，ROS）為核心的氧應激和脂質過氧化（1ipidperoxidation，LPO）對肝臟造成的進一步損害理論，即“二次打擊”學說。此外，還有營養、遺傳、免疫和環境等因素的參與。近年來，對于NASH的免疫學發病機制的研究越來越受到重視。本文重點介紹天然免疫與NASH發病的關系。

一、天然免疫的概念及其在NASH發病機制中的研究

從分子機制出發，把有關天然免疫受體稱作模式識別受體（Pattern recognition receptor，PRRs），其識別的病原微生物的對應分子被稱為病原體相關分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），來自于宿主體內的則稱為內源性危險相關的分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs），而天然免疫系統通過公認的四類模式識別受體（PRRs）來識別:即 Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs），核苷酸寡聚結合域（nucleotide-binding oligomerization domain，NOD），NOD樣受體（NLRs）和其他。

在肝臟，激活天然免疫系統對于維持體內內環境的平衡和肝臟再生以及疾病的發病有重要作用。免疫系統激活與其他機制的協同作用較其獨立作用更重要一些。天然免疫的主要組成部分，如肥大細胞、自然殺傷T細胞（natural killer T cells，NKT cells）、補體蛋白、模式識別受體的分泌、急性期反應物等均有重要作用并廣為大家認同。

二、Toll樣受體及其主要受體成員在NASH發病中的作用

TLRs是參與天然免疫的一類重要蛋白質分子，也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁。TLRs是單個的跨膜非催化性蛋白質，就如同天然免疫的眼睛，能監視與識別各種不同的PAMPs[5]。其中TLR4不僅可識別革蘭氏陰性菌脂多糖（LPS），還可識別宿主壞死細胞釋放的熱休克蛋白（heat-shock proteins，HSP），體內類肝素硫酸鹽和透明質酸鹽降解的多糖部分以及局部的內源性酶的級聯活化反應也可激活TLR4。TLR2、TLR5及TLR9等可分別識別脂蛋白，鞭毛蛋白，及細菌的CpG-DNA，激活B細胞和APC的免疫刺激特性，發揮天然免疫屏障功能。

（一）TLR4是NASH發生“腸-肝軸”理論的連接點 已證實LPS是TLR4的主要配體[6]，而內毒素與肝纖維化的關系早已達成共識。因此，TLR4被認為與革蘭氏陰性細菌及其內毒素的識別和激活有關，但TLR4在肝纖維化中的作用和地位還未完全被人們所了解。研究發現在由喂食高脂或者高果糖餐及膽堿-蛋氨酸缺乏飲食建立的小鼠NASH模型，TLR4及其受體的表達增高，并表現出高內毒素血癥[7]。給予標準飲食喂養的野生型小鼠在接受了低劑量的LPS注射后也出現了脂肪肝的表現，提示腸-肝軸在NASH發病中的重要性[8]。相比之下，在用高脂飲食建立TLR4突變小鼠NASH模型時，肝內脂肪水平減低，提示在枯否氏細胞和肝星狀細胞中的細胞炎癥和纖維化是依賴于TLR4介導的信號通路。對于更為精確的信號機制進一步研究表明，其下游分子伴侶蛋白、轉錄因子和活性氧族（ROS）可能不同程度地影響了NASH的發生及發展[9]。在這些小鼠模型研究表明，從良性脂肪變性到脂肪性肝炎經歷了多重打擊，與臨床上NAFLD患者疾病的發生及發展歷程相符合[10]。

（二）TLR9-MyD88通路是細胞因子介導肝細胞損傷的重要環節 內生性TLR9主要識別非甲基化的CpG結構，該結構普遍存在于細菌DNA和內源性的凋亡肝細胞DNA上。由CpG或者凋亡肝細胞DNA處理的人類和小鼠肝星狀細胞可表現為纖維化的細胞因子水平升高和細胞活化形態學改變，而這種改變可以被TLR9拮抗劑所阻斷[11]。在肝纖維化的體內模型研究中，進一步支持TLR9在肝星狀細胞的活化和纖維化中起重要作用。TLR9-MyD88信號同時介導枯否氏細胞IL-1β的產生，后者可以同時刺激肝細胞和肝星狀細胞，導致NASH的發生及發展[12]。確實，阻斷小鼠體內的IL-1的信號通路可以減輕TLR9介導的肝臟損傷。所以，阻斷這條信號通路或許對于治療肝損傷具有重要意義[12]。

（三）TLR2與NASH發生關系密切 TLR2具有相對廣泛的配體特異性，可識別多種病原體相關分子模式，包括細菌、真菌和原生動物的組件，并且具有獨特辨別不同特定配體的能力。TLR2的激活與大量的促炎細胞因子和趨化因子的產生有關。鑒于這種復雜性，TLR2在NAFLD中的確切作用尚不肯定。

早期研究表明，缺乏TLR2信號是保護高脂飲食小鼠模型中脂肪變性的重要因素[13]。2013年，Miura等重復以前的研究，再次發現TLR2基因敲除小鼠在給予膽堿-蛋氨酸缺乏飲食（MCD）后，的確出現了炎癥減輕的情況。但另外也有研究發現，TLR2基因敲除小鼠在給予MCD飲食后出現了TLR4的高表達，并增加了NASH的發生。有趣的是，TLR2的上述作用會被喂食飽和脂肪酸減弱。盡管需要更多的實驗，這些矛盾的研究結果揭示了TLR2對于不同的外來刺激表現出的不同的應激效應。

三、NLR炎性小體在NASH發生及其維持腸道菌群平衡中的作用

NOD樣受體（NLR）炎性小體（Inflammasomes）是一種多重的蛋白質復合物，可以推進前細胞凋亡蛋白酶對于PAMPS或內源性危險相關的分子模式（DAMPS）產生必要的應答。NLRs介導廣泛的免疫和細胞凋亡信號通路。到目前為止，NLR家族蛋白在人類中已發現23種分子，在小鼠中至少有34種分子。NLR家族成員的結構特征是其N端是效應結構域，主要介導蛋白之間的相互作用。已知主要存在四種N端結構域:CARD結構域、PYD結構域、BIR結構域和轉錄激活結構域。NLR家族蛋白的中間部分是NOD結構域，主要在激活過程中介導自身寡聚化。蛋白C端是亮氨酸富集結構域（LRR），介導自身調控和識別PAMP。NLRP3炎癥小體是目前研究得最多的一種炎癥小體，它不僅能被許多細菌、病毒等病原體所激活，同時也能被體內自身產生的“危險信號”激活。

NLRP3可以由具有CARD結構的蛋白及caspase-1蛋白所激活。Caspase-1在細胞凋亡中有重要的作用，并且也是IL-1β和IL-18分泌的主要機制。炎癥小體（特別是NLRP3的激活）和IL-1信號通路在很多肝臟疾病如缺血-再灌注損傷、藥物性肝損傷、病原體或者內毒素相關的病理變化及NAFLD和肝纖維化過程中均參與了發病過程。在肝臟，由飲食和腸道微生物群激活炎癥小體信號通路是目前研究的熱點問題。眾所周知，炎癥小體可以被ROS所激活，而ROS參與了NASH體內模型的TLR4介導的炎癥反應過程。在NASH發生和炎癥小體激活的下游信號途徑中，IL-1信號的重要性已經在很多飲食導致的小鼠模型中通過各種IL-1信號通路蛋白敲除模式體現出來。這一觀點在NASH患者得到證實，其血清IL-1Ra水平和IL-R在肝臟組織中的表達均是增加的。

NLPR3在脂肪酸所導致的炎癥反應中發揮重要作用。在NLRP3基因敲除小鼠，給予高脂飲食9個月后，肝臟病理病變減輕[20]。然而，2012年的一項研究表明NLRP3有更加復雜的作用，其中包括與腸道細菌的相互作用。

四、NKT在NASH發生中的作用

NKT細胞是一群細胞表面既有T細胞受體（TCR），又有NK細胞受體的特殊T細胞亞群。NKT細胞可以分為CD1d限制性NKT細胞，其又可以分為I型NKT細胞（invariant NKT cells，iNKT cells），即半恒定NKT細胞，表達恒定TCRα鏈和某些β鏈，主要識別鞘糖脂抗原（α-GalCer），和Ⅱ型NKT細胞，后者表達不同的TCRα鏈，不識別α-GalCer；另一類是CD1d非限制性NKT細胞，又稱NKT樣細胞。目前對這類細胞知之甚少。進展期的NASH表現為肝臟增加的炎癥細胞浸潤，提示該疾病的進展主要來自于炎癥的推動。NKT細胞在正常的肝血竇內表達，該細胞被認為在病毒感染、腫瘤免疫和自身免疫性疾病中連接天然免疫和獲得性免疫。它們在NAFLD的明確作用仍存在爭議。我們綜合NKT細胞的現有知識，認為NKT參與了從脂肪變性到NASH的整個過程。此外，NKT細胞和半恒定NKT細胞（CD1d-依賴，iNKT細胞）的數量在人類和小鼠的肝臟中存在顯著差異。不同的NKT細胞亞型在該疾病的進展中所發揮的不同作用目前還不清楚。在人類，研究發現外周和肝臟NKT細胞出現的頻率與非酒精性脂肪肝的進展相關。脂肪變性與肝臟NKT細胞數量的減少相關。在人NASH，隨著脂肪變性程度的增加，肝組織NKT細胞數量減少。相比之下，進展為NASH伴炎癥的患者肝臟卻表現為NKT細胞的增加。Adler等認為NKT細胞在中度至重度脂肪變性患者肝臟和血清中的水平增加，而iNKT細胞數變化不大。

在肝纖維化小鼠，有研究發現缺乏NKT細胞的小鼠肝纖維化程度減輕，推測與減輕了Hedgehog和骨橋蛋白信號通路作用有關。這兩條信號通路都是與人類NASH的進展密切相關的。另有研究顯示NKT細胞消耗可以導致代謝的改變。高脂飲食可以導致肝臟磷脂活化。研究還發現，iNKT細胞基因敲除小鼠通過增加T細胞激活的炎癥因子和趨化因子的基因表達，增加了飲食導致的肝臟炎癥反應。

近來研究表明，機體免疫因素參與了NASH的發生，其中肝細胞、枯否氏細胞、pit細胞、星狀細胞和內皮細胞等都參與了肝臟的免疫調節。TLRs、NLRs和NKT等是其主要的免疫調節相關因素。它們通過各自不同的信號途徑發揮效應，從而導致NASH的啟動，并促進肝纖維化乃至肝硬化的發生。

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