卷曲霉素在羅氏培養基中的穩定性研究

江勇 錢明 王威 陳濤 李海成 陳燕梅 卓文基 郭卉欣 周琳 鐘球

·論 著 ·

卷曲霉素在羅氏培養基中的穩定性研究

江勇 錢明 王威 陳濤 李海成 陳燕梅 卓文基 郭卉欣 周琳 鐘球

目的 檢測卷曲霉素（Cm）在羅氏培養基中的穩定性，了解Cm在羅氏培養基中的降解速率；檢測Cm降解對藥物敏感性試驗結果的影響。方法 用高效液相色譜儀分別檢測4℃和37℃2種保存條件下，Cm在羅氏培養基中的穩定性；使用不同保存條件下的羅氏培養基進行藥物敏感性試驗，以驗證Cm降解對敏感性試驗結果的影響。結果 在4℃保存時，羅氏培養基中的Cm含量與時間呈反比，保存10 d時，羅氏培養基中的Cm降解2.04%，保存40 d時，Cm降解21.5%，保存80 d時，Cm降解41.7%，保存到200 d時，檢測不到Cm的存在；在37℃保存10 d時，羅氏培養基中的Cm降解46.8%；在37℃保存30 d時，無法在羅氏培養基中檢測到Cm的存在。在4℃存儲時間為10～160 d的Cm羅氏培養基進行結核分枝桿菌藥物敏感性試驗（DST）時，MIC在0.8～1.0μg/ml菌株，在4℃存儲時間為40 d的Cm羅氏培養基上生長6周后出現16個菌落。MIC在1.0～1.5μg/ml菌株，在4℃存儲時間為40 d的Cm羅氏培養基上生長6周后出現陽性結果（十）。結論 Cm羅氏培養基在37℃保存時不穩定，在4℃保存時相對穩定，但存儲時間不應超過40 d。

分枝桿菌，結核； 培養基； 微生物敏感性試驗； 卷曲霉素硫酸鹽； 色譜法，高壓液相

結核病（tuberculosis）是結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）通過空氣傳播感染的慢性傳染病，是主要的國際公共衛生問題之一。據估計，全球每年大約有接近800萬例感染結核病［1-2］。近年來結核病的總體發病率在下降，但是結核病耐藥現象卻逐漸變得嚴重［3-4］。不恰當的管理措施和治療方案是導致耐藥菌增加，以及耐藥程度加重的主要原因［5］。目前，耐藥結核病的診斷主要依賴于實驗室的藥物敏感性試驗（DST）結果，DST是一個步驟很多的復雜性試驗，對DST的結果造成影響的因素較多，本研究關注了含藥培養基中藥物穩定性對DST結果的影響，目的是了解含藥培養基中藥物不穩定性是否是DST不準確的一個原因，通過本研究對含藥培養基有效期的確定提供實驗室數據支持。

材料和方法

1.菌株及試劑：結核分枝桿菌H37Rv標準株（ATCC93009）來自中國藥品生物制品檢定所；9株結核分枝桿菌臨床分離株由佛山市第四人民醫院提供；卷曲霉素（Cm）購自于Sigma公司（美國）；硫酸卷曲霉素（用于HPLC方法學驗證）購自于海正藥業股份有限公司；甲醇、異丙醇為色譜純，購自于Sigma公司（美國）。

2.主要設備：高效液相色譜儀（high performance liquid chromatograph，HPLC），L-6200三元泵，L-4200紫外檢測器，655A-40自動進樣器，655A-52柱溫箱，D-2000色譜整合器購自于Hitachi公司（日本）。組織勻漿機購自于QIAGEN公司（美國）。

3.實驗方法：用HPLC監測羅氏培養基Cm的濃度。硫酸卷曲霉素配制成最終濃度為90 mg/ml的內標液；取Cm羅氏培養基約0.5 ml加入1 ml的99.99%純度的甲醇放在組織勻漿機中混勻；5000×g離心10 min，取上清液進行高效液相色譜分析。使用4℃存儲時間為10、20、30、40、60、80、120、160 d 的Cm羅氏培養基進行比例法藥敏試驗。選擇3株已知最低抑菌濃度（MIC）的結核分枝桿菌臨床分離株進行比例法藥敏試驗：1株MIC＜0.05μg/ml；1株MIC在0.8～1.0μg/ml；1株MIC在1.0～1.5μg/ml。比例法DST根據WHO指南，在含40μg/ml Cm的羅氏培養基上接種菌濃度為10-2g/L和10-4g/L時的菌落形成單位（CFU）臨床分離株，質控菌株H37Rv（MIC在0.1～0.2μg/ml）作為對照菌株。

HPLC方法有效性評價：HPLC測定Cm濃度方法的準確性和精確性見表1，對Cm低、中、高3個濃度監測發現Cm日內和日間的相對標準差（RSD）分別＜1.98%和＜2.78%。對于所有測試樣本Cm回收率在98.99%～103.91%。Cm在不同介質中標準曲線在5～50μg/ml的濃度范圍內表現出了良好的線性關系，r均＞0.998（表1）。HPLC檢測Cm濃度時，Cm在羅氏培養基的最低檢測限（LOD）為0.09μg/ml，最小定量限（LOQ）為0.25μg/ml。

結 果

1.Cm在羅氏培養基中的穩定性：在37℃保存時，Cm在羅氏培養基中10 d后就降解了46.8%，于30 d后無法檢測到羅氏培養基中的Cm存在。

表1 3種Cm濃度HPLC檢測的準確性和精確性

含Cm的羅氏培養基在4℃保存時，保存10 d時，羅氏培養基中的Cm降解2.04%，保存40 d時，Cm降解21.5%，保存80 d時，Cm降解41.7%，保存到200 d時，檢測不到Cm的存在（圖1）。

圖1 含Cm的羅氏培養基在37℃、4℃保存條件下Cm的降解情況

2.比例法藥敏試驗結果：對部分MIC值接近或小于耐藥臨界值的結核分枝桿菌臨床分離株和對照菌株H37Rv進行比例法DST檢測。在新鮮制備的和在4℃存儲時間分別為10～160 d的含Cm羅氏培養基中，對同一菌株進行比例法DST檢測。當Cm對臨床菌株的MIC＜0.05μg/ml時，不同存儲時間的羅氏培養基上進行的DST檢測結果差異沒有統計學意義。當臨床菌株的 MIC在臨界值附近時，不同存儲時間的DST檢測結果差異有統計學意義；在存儲時間超過40 d的羅氏培養基中，原本敏感的菌株可能會出現一個耐藥的結果，并且含Cm羅氏培養基存儲時間越長，菌落出現的越早；在4℃存儲時間為160 d的含Cm羅氏培養基中，菌落出現要早于其他存儲時間的含Cm羅氏培養基。部分結核分枝桿菌臨床分離株和對照菌株H37Rv的比例法藥敏試驗結果見表2。

討 論

隨著耐藥結核病在世界范圍內的流行越來越廣泛，以羅氏培養基為基礎的DST檢測技術在臨床上的應用也越來越多。羅氏培養基為基礎的DST檢測技術在結核病高負擔和低收入國家廣泛應用。但是羅氏培養基為基礎的DST檢測技術存在一些缺

點，眾所周知的就是使用固體培養基進行DST非常耗時，需要6周（比例法）時間報告結果，且結果有時不一致且重復性較低。另一個缺點是，該技術還沒有完全標準化。雖然世界衛生組織制定了以羅氏培養基為基礎的DST檢測技術的標準操作程序，但有些指標很難標準化，例如，羅氏培養基的質量等。諸多不確定因素使得建立關于固體培養基DST的外部質量保證體系存在困難，由此也影響了實驗室間同類檢測數據的可比性。

表2 不同樣本、MIC濃度與存儲時間的結核分枝桿菌的比例法DST檢測結果

關于HPLC測定RFP濃度的方法已被報道［6-8］，但并沒有關于檢測羅氏培養基Cm濃度的方法報道。本研究建立了一種快速、準確、可重復的以高效液相色譜法測定羅氏培養基中Cm濃度的方法，可以作為一種對含Cm培養基進行質量控制的方法。

含Cm培養基在4℃保存時相對于在37℃時保存要穩定，但是隨著存儲時間的延長，Cm的降解也很明顯（圖1）。從理論上講，隨著存儲時間的延長，培養基中的Cm濃度降低，則使用不同存儲時間的培養基進行DST必然會產生一些不一致的檢測結果，勢必有部分敏感株在存儲時間較長的培養基中DST檢測結果為耐藥。根據對含Cm的羅氏培養基在存儲過程中藥物穩定性的檢測數據，不推薦使用存儲超過40 d的含Cm羅氏培養基進行DST檢測；本研究中多項數據表明，培養基中藥物的降解可能是導致實驗室DST檢測結果“假陽性”的一個原因。

［1］Bloom BR，Murray CJ.Tuberculosis：commentary on a reemergent killer.Science，1992，257（5073）：1055-1064.

［2］閆麗萍，唐神結，秦蓮花，等.對利福平敏感的多耐藥結核分枝桿菌rpoB基因突變一例.中國防癆雜志，2013，35（2）：146-148.

［3］Sharma SK，Mohan A.Multidrug-resistant tuberculosis：a menace that threatens to destabilize tuberculosis control. Chest，2006，130（1）：261-272.

［4］孫蕾，王毳，趙卓，等.銜接分子胱天蛋白酶募集域蛋白9與抗結核免疫的相關性.中國防癆雜志，2013，35（3）：204-206.

［5］Mukherjee JS，Rich ML，Socci AR，et al.Programmes and principles in treatment of multidrug-resistant tuberculosis. Lancet，2004，363（9407）：474-481.

［6］Leonard B，Coronel J，Siedner M，et al.Inter-and intra-assay reproducibility of microplate Alamar blue assay results for isoniazid，rifampicin，ethambutol，streptomycin，ciprofloxacin，and capreomycin drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis.J Clin Microbiol，2008，46（10）：3526-3529.

［7］El-Sayed Zaki M，Goda T.Rapid phenotypic assay of antimycobacterial susceptibility pattern by direct mycobacteria growth indicator tube and phage amplified biological assay compared to BACTEC 460 TB.Tuberculosis（Edinb），2007，87 （2）：102-108.

［8］Yu X，Jiang G，Li H，et al.Rifampin stability in 7H9 broth and L?wenstein-Jensen medium.J Clin Microbiol，2011，49 （3）：784-789.

The research on capreomycin stability in Roche medium

JIANG Yong*，QIAN Ming，WANG Wei，CHEN Tao，LI Hai-cheng，CHEN Yan-mei，ZHUO Wen-ji，GUO Hui-xin，ZHOU Lin，ZHONG Qiu.*Center for Tuberculosis Control and Prevention of Guangdong Province，Guangzhou 510630，China

ZHOU Lin，Email：gdtb-bg@vip.163.com；ZHONG Qiu，Email：zhongqiu@vip.163.com

Objective To detect the stability of capreomycin（Cm）in the Roche medium，and find out the degradation rate of Cm in Roche medium and to detect the influence of Cm degradation on drug sensitive test. Methods The high performance liquid chromatograph（HPLC）test was used to detect the stability of Cm under preservation condition of 4℃and 37℃in Roche medium；Cm under different preservation condition was used to conduct drug sensitive test（DST）to detect the influence of Cm degradation on drug sensitive test.Results Preserved in 4℃，the concentration of Cm in Roche medium is inversely proportional to time，the degradation of Cm in Roche medium is close to 2.04%after 10 days，the degradation is 21.5%after 40 days，the degradation is 41.7% after 80 days，and Cm was not detected after 200 days.Preserved in 37℃，the degradation of Cm in Roche medium is close to 46.8%after 10 days，and Cm was not detected after 30 days.In the Cm Roche medium preserved at 4℃for 10-160 days，DST results showed that in the strain which minimal inhibitory concentration（MIC）is between 0.1 to 0.2μg/ml，16 colonies were observed after 6 weeks in the Roche medium preserved in 4℃for 40 days.In the strain which MICis between 1.0 to 1.5μg/ml，positive result（十）was reported after 6 weeks in the Roche medium preserved in 4℃for 40 days.Conclusion Cm Roche medium is unstable when stored at 37℃，it should be preserved at 4℃and should be used within 40 days.

Mycobacterium tuberculosis； Culture media； Microbial sensitivity tests； Capreomycin sulfate；Chromatography，high pressure liquid

2013-06-06）

（本文編輯：薛愛華）

“十二五”國家科技重大專項（2013ZX10003001）

510630廣州，廣東省結核病控制中心（江勇、錢明、陳濤、李海成、陳燕梅、卓文基、郭卉欣、周琳、鐘球）；廣東省佛山市第四人民醫院檢驗科（王威）

周琳，Email：gdtb-bg@vip.163.com；鐘球，Email：zhongqiu@vip.163.com