VDR-TaqⅠ、FokⅠ位點(diǎn)多態(tài)性與寧夏人群結(jié)核易感性研究

陳丹丹 朱圭娜 關(guān)光玉 Magda Ellis Donald P.Mc Manus 楊玉榮

·論 著 ·

VDR-TaqⅠ、FokⅠ位點(diǎn)多態(tài)性與寧夏人群結(jié)核易感性研究

陳丹丹 朱圭娜 關(guān)光玉 Magda Ellis Donald P.Mc Manus 楊玉榮

目的 探討維生素D受體（VDR）基因TaqⅠ、FokⅠ位點(diǎn)基因多態(tài)性與寧夏回族自治區(qū)人群肺結(jié)核易患性之間的關(guān)系。方法 搜集寧夏南部8個(gè)地區(qū)2010年7—11月確診的肺結(jié)核患者993例（簡(jiǎn)稱“病例組”），其中男550例，女443例；同期選擇來源地區(qū)，與病例組性別相同、民族相同、年齡相當(dāng)、居住環(huán)境相匹配的確認(rèn)無肺結(jié)核的健康人880名（簡(jiǎn)稱“對(duì)照組”），其中男485名，女395名。將聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCRRFLP）檢測(cè)VDR基因多態(tài)性的方法，應(yīng)用于人群結(jié)核病易感性的病例-對(duì)照研究。用SPSS 16.0軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，各基因型與結(jié)核易感性關(guān)系用單因素分析和多因素logistic回歸分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果VDR-TT、Tt、tt基因型在病例組和對(duì)照組中分布頻率分別為83.0%（815/982）、15.2%（149/982）、1.8%（18/982）和84.7%（739/872）、14.7%（128/872）、0.6%（5/872），病例組與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 6.15，P=0.046）。VDR-FF、Ff、ff基因型病例組和對(duì)照組分布頻率分別為32.4%（316/976）、47.9%（468/976）、19.7%（192/976）和28.5%（245/861）、53.3%（459/861）、18.2%（157/861），病例組和對(duì)照組分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.41，P=0.067）。在顯性基因模型中，VDR-（TT十Tt）、tt基因型病例組和對(duì)照組中分布頻率分別為98.2%（964/982）、1.8%（18/982）和99.4%（867/872）、0.6%（5/872），病例組和對(duì)照組中分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.98，P=0.014；OR=0.98、3.19，95%CI=0.978～0.997、1.193～8.574）；在純合基因模型中VDR-（FF十ff）、Ff基因型在病例組和對(duì)照組中頻率分別為52.0%（508/976）、48.0%（468/976）和46.7%（402/861）、53.3% （459/861），病例組和對(duì)照組分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.27，P=0.022；OR=1.12、0.89，95%CI=1.023～1.298、0.822～0.985）。結(jié)論 在寧夏人群中，肺結(jié)核易患性可能與VDR-TaqⅠ、FokⅠ位點(diǎn)多態(tài)性有關(guān)聯(lián)，VDR-（FF十ff）、tt基因型可能是罹患肺結(jié)核的危險(xiǎn)因素，而VDR-（TT十Tt）、Ff基因型可能是保護(hù)因素。

結(jié)核，肺/遺傳學(xué)； 受體，骨化三醇； 多態(tài)性，單核苷酸； 疾病遺傳易感性； 病例對(duì)照研究；寧夏［回族自治區(qū)］

維生素D（Vit D）的經(jīng)典生物學(xué)功能是調(diào)節(jié)機(jī)體鈣磷代謝。但是，近年來研究發(fā)現(xiàn)，Vit D在體液免疫和細(xì)胞免疫方面具有重要的調(diào)節(jié)功能［1-2］，與機(jī)體抗結(jié)核分枝桿菌的免疫保護(hù)機(jī)制有關(guān)。Vit D的活性代謝產(chǎn)物是1，25-二羥維生素D3，該產(chǎn)物生物學(xué)功能的發(fā)揮由Vit D受體（VDR）蛋白介導(dǎo)。人類VDR基因位于第12染色體長(zhǎng)臂，其中，rs731236、rs2228570位點(diǎn)分別對(duì)應(yīng)限制性內(nèi)切酶TaqⅠ、FokⅠ的酶切位點(diǎn)［3］，兩位點(diǎn)位于基因外顯子處，單核苷酸的變化導(dǎo)致表達(dá)的維生素D受體蛋白異常，進(jìn)而影響Vit D功能的正常發(fā)揮［4-5］，從而對(duì)結(jié)核的易感性產(chǎn)生一定影響。目前，有關(guān)VDR基因多態(tài)性與該地區(qū)肺結(jié)核易感性的相關(guān)報(bào)道較少，值得進(jìn)一步研究。

聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）可用于檢測(cè)單核苷酸位點(diǎn)堿基的變化，且該方法簡(jiǎn)便，分型時(shí)間短，實(shí)驗(yàn)可在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室完成。病例-對(duì)照研究方法可通過某研究因素在病例組和對(duì)照組之間的分布差異，探究研究因素與疾病發(fā)生之間的關(guān)聯(lián)性，也是用于探索疾病的危險(xiǎn)因素和病因的常用分析流行病學(xué)方法。為此，本研究以病例-對(duì)照研究方法為基礎(chǔ)，采用PCR-RFLP探討VDR-TaqⅠ、FokⅠ位點(diǎn)基因多態(tài)性與寧夏人群肺結(jié)核發(fā)病的關(guān)系。為今后確定高危人群、肺結(jié)核的預(yù)防和治療等奠定基礎(chǔ)，提供可靠依據(jù)。

材料和方法

一、研究對(duì)象和實(shí)驗(yàn)材料

1.研究對(duì)象：病例組來源于寧夏西吉、海原、涇源、彭陽、原州、同心、中衛(wèi)、隆德8個(gè)地區(qū)，并且在該地區(qū)居住10年以上的患者。2010年7—11月，按照結(jié)核病診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］，經(jīng)8地區(qū)的疾病預(yù)防控制中心相關(guān)專家確診的肺結(jié)核患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：年滿18周歲，痰涂片或分離培養(yǎng)陽性，胸透X線片顯示結(jié)核征象，有臨床表現(xiàn)，咳嗽或咯痰2周以上或咯血；排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有糖尿病、高血壓、哮喘、慢性阻塞性肺結(jié)核病、肺癌等并發(fā)癥，排除HIV、肝炎病毒感染，腫瘤患者及長(zhǎng)期使用激素和器官移植等使免疫功能低下者。

對(duì)照組為同期選擇的，來源于該8個(gè)地區(qū)的健康人群，與納入患者性別相同，民族相同，年齡相當(dāng)?shù)耐l(xiāng)。納入標(biāo)準(zhǔn)：年滿18周歲，無結(jié)核病，排除標(biāo)準(zhǔn)同病例組。

根據(jù)前期回顧性調(diào)查，寧夏南部地區(qū)登記的肺結(jié)核病的年患病率，估計(jì)每年為500/10萬～700/10萬。以α=0.05，β=0.5～0.8，樣本量至少應(yīng)該≥1800才具有檢驗(yàn)效能為50%～80%。具體由：http：// pngu.mgh.harvard.edu/～purcell/gpc/cc2.html，計(jì)算所得。

共收集標(biāo)本1873份。其中，病例組993例，其中男550例，女443例；漢族413例，回族580例；18～75周歲，平均年齡（48.4±18.2）歲。對(duì)照組經(jīng)排查后，符合要求的為880名，其中男485名，女395名；漢族359名，回族521名；18～75周歲，平均年齡（46.8±16.6）歲。最后分析時(shí)，剔除無實(shí)驗(yàn)結(jié)果的樣本后，TaqⅠ位點(diǎn)病例組982例，對(duì)照組872例，F(xiàn)okⅠ位點(diǎn)病例組976例，對(duì)照組861例。因調(diào)查地區(qū)漢族與回族通婚頻繁，民族血統(tǒng)不純正，最后分析時(shí)，未考慮民族對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

病例組和對(duì)照組性別構(gòu)成差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.14，P=0.91），年齡構(gòu)成差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.91，P=0.06）。

2.儀器設(shè)備：制冰機(jī)：寧波格蘭特制冷設(shè)備制造有限公司XB70；低溫高速離心機(jī)：美國(guó)貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司TJ-6；核酸蛋白分析儀：Thermo NANODROP 2000；PCR儀：BIO-Cyclery；凝膠成像儀：BIO-RAD Image Lab 3.0。電泳儀：北京市六一儀器廠DYY-6C；電泳槽：北京市六一儀器廠DYCP-31DN。

3.試劑耗材：10%十二烷基磺酸鈉（SDS）：Sigma公司生產(chǎn)；Proteinase K（Sigma ALDRICH Lot# 080M8609V）：Sigma公司生產(chǎn)；RNase A（Cat No.12091-039 Lot：1253939）：Invitrogen公司生產(chǎn)；PCR試劑（Promega Go Taq Colorless Master Mix）：Promega公司生產(chǎn)；FokⅠ（D1046B）：TaKa-Ra（大連）寶生物工程；TaqⅠ：Promega公司生產(chǎn)。

二、方法

（一）調(diào)查方法

所有參加者為自愿參加，并簽署《知情同意書》。對(duì)所有參加者提供免費(fèi)的一般性的臨床檢查和一次乙型肝炎（簡(jiǎn)稱“乙肝”）全套檢查和肝功能檢查。隨后進(jìn)行一對(duì)一的問卷調(diào)查填寫《肺結(jié)核易感性調(diào)查登記表》，調(diào)查表主要由澳大利亞結(jié)核研究所課題組Ellis博士和昆士蘭醫(yī)學(xué)研究所的Mc Manus教授和楊玉榮教授商定，調(diào)查人員為各縣市CDC結(jié)核病防治所相關(guān)負(fù)責(zé)人員，工作開展前對(duì)調(diào)查人員在寧夏醫(yī)科大學(xué)集中2 d培訓(xùn)，收集標(biāo)本的過程中集中討論遇到的問題及解決辦法。調(diào)查內(nèi)容除基本信息（姓名、性別、年齡、民族、家庭住址、聯(lián)系方式等）外，還包括結(jié)核既往史、卡介苗接種史、乙肝史、其他疾病史。同時(shí)用一次性抗凝采血管抽取靜脈血5 ml，-80℃凍存?zhèn)溆谩Ｔ跇?biāo)本收集初期課題組人員現(xiàn)場(chǎng)跟蹤收集標(biāo)本的全過程，所收集標(biāo)本暫時(shí)存放于各縣市CDC實(shí)驗(yàn)室的-20℃或-80℃冰箱中，每個(gè)月集中送往寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

（二）檢測(cè)方法

1.基因組DNA提取：采用裂解紅細(xì)胞法［7］，低滲溶解紅細(xì)胞，離心收集白細(xì)胞，以10%SDS裂解白細(xì)胞，以Proteinase K消化蛋白，以RNase A降解RNA，以異丙醇和乙醇抽提和洗滌DNA，最后以1×Tris-EDTA buffer（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，p H=8.0）溶解基因組DNA。用核酸定量?jī)x測(cè)量DNA的純度和濃度。1.8＜A260/A280＜2.0，則DNA純度符合要求。

2.PCR擴(kuò)增：采用在線引物設(shè)計(jì)軟件Primer 3設(shè)計(jì)引物（TaqⅠ：上游5′-CTAAATGCACGGAGAAGTCACTG-3′，下游5′-TTCTGGATCATCTTGGCATAGAG-3′；FokⅠ：上游5′-AGCTATGTAGGGCGAATCATGT-3′，下游5′-TCCAAGAGAGTCAGAGGAACATC-3′），由Invitrogen公司合成。采用96孔板進(jìn)行PCR反應(yīng)，TaqⅠ位點(diǎn)PCR反應(yīng)體系25μl：Master Mix 12.5μl，上/下游引物各0.5μl（5 pmol），模板2μl（100 ng），無核酸酶水9.5μl。循環(huán)條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)，72℃總延伸5 min。FokⅠ位點(diǎn)PCR反應(yīng)體系25μl：Master Mix 12.5μl，上/下游引物各0.5μl（5 pmol），模板1μl（50 ng），無核酸酶水10.5μl。循環(huán)條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，72℃總延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物采用2%的瓊脂糖凝膠［溴化乙錠（EB）濃度0.5μg/ml］，電壓120 V，1 h電泳檢測(cè)，可用。

3.酶切分型：以DNA含量較多的樣本進(jìn)行酶切作用預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定酶切反應(yīng)時(shí)酶的濃度、酶切作用的溫度和時(shí)間、電泳分型凝膠的大小，電泳電壓和時(shí)間，選取用于檢測(cè)酶切作用效果的控制標(biāo)本1（C1）和控制標(biāo)本2（C2）。C1為ttff基因型，酶切后TaqⅠ位點(diǎn)2個(gè)片段（219 bp、102 bp）、FokⅠ位點(diǎn)3個(gè)片段（345 bp、156 bp、63 bp）；C2為TtFt基因型，酶切后TaqⅠ位點(diǎn)3個(gè)片段（321 bp、219 bp、102 bp）、FokⅠ位點(diǎn)4個(gè)片段（408 bp、345 bp、156 bp、63 bp）。以最佳反應(yīng)條件用于實(shí)驗(yàn)。

采用96孔板進(jìn)行酶切。每板添加C1、C2、無菌水各一個(gè)。酶切作用后C1、C2、無菌水均符合理論結(jié)果，該板結(jié)果可用，否則重新試驗(yàn)。TaqⅠ位點(diǎn)酶切體系：PCR產(chǎn)物7μl，TaqⅠ酶0.5μl（5 U），BSA 2μl，Buffer E 2μl，補(bǔ)無菌水到20μl，37℃酶切3 h。FokⅠ位點(diǎn)酶切體系：PCR產(chǎn)物9μl，F(xiàn)okⅠ酶（TaKaRa公司）0.5μl（5 U），10×M 2μl，BSA 2μl，補(bǔ)無菌水到20μl，37℃酶切2 h。酶切產(chǎn)物取10μl，以50 bp或100 bp DNA Marker為對(duì)照，采用3%的瓊脂糖凝膠，120 V，1 h，電泳檢測(cè)。

酶切分型：VDR-TaqⅠ位點(diǎn)若為等位基因T，則PCR產(chǎn)物中不存在TaqⅠ酶切位點(diǎn)，酶切產(chǎn)物為321 bp 1個(gè)片段，若為等位基因t，則存在一個(gè)酶切位點(diǎn)，酶切產(chǎn)物為219 bp、102 bp 2個(gè)片段，因此，酶切后可產(chǎn)生三種基因型TT（321 bp），Tt（321 bp、219 bp、102 bp）和tt（219 bp、102 bp）（圖1）。VDRFokⅠ位點(diǎn)若為等位基因F，則PCR產(chǎn)物中有一個(gè)酶切位點(diǎn)，酶切產(chǎn)物為408 bp、156 bp 2個(gè)片段，若為等位基因f，PCR產(chǎn)物有兩個(gè)酶切位點(diǎn)，酶切產(chǎn)物為345 bp、156 bp和63 bp 3個(gè)片段，酶切后可產(chǎn)生FF（408 bp、156 bp），F(xiàn)f（408 bp、345 bp、156 bp、63 bp）和ff（345 bp、156 bp、63 bp）3種基因型（圖2）。

1、2、3、M分別表示tt、TT、Tt基因型和100 bp Marker 圖1 VDR-TaqⅠ酶切電泳圖片

1、2、3、M分別表示ff、Ff、FF基因型和50 bp Marker 圖2 VDR-FokⅠ酶切電泳圖片

（三）數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用雙人平行錄入法，由兩人同時(shí)將數(shù)據(jù)以Excel表格形式錄入計(jì)算機(jī)，并進(jìn)行一致性核對(duì)，確保數(shù)據(jù)輸入無誤。采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。病例組與對(duì)照組一般情況進(jìn)行均衡性比較；進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測(cè)；各基因型與肺結(jié)核的相關(guān)性采用χ2檢驗(yàn)，為排除混雜因素的影響，進(jìn)一步分析采用多因素logistic回歸分析。OR值表示病例組與對(duì)照組的優(yōu)勢(shì)比，OR=1，說明變量對(duì)疾病不起作用，OR＞1，說明變量是危險(xiǎn)因子，反之是保護(hù)因子。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

（四）所用公式

基因型頻率（觀測(cè)值）：通過測(cè)定群體中某種基因型在該群體中所占的率。

等位基因頻率（觀測(cè)值）：通過測(cè)定群體中某種等位基因在該群體中所占的率。

基因型頻率（期望值）：根據(jù)Hardy-Weinberg平衡定律計(jì)算的某種基因型在該群體中所占的率。

即（PT十Pt）2=PT2十2·PT·Pt十Pt2=1，TT基因型頻率PTT=PT2；

TT基因型頻數(shù)：=N·PTT；

Tt基因型頻率PTt=2·PT·Pt；

Tt基因型頻數(shù)=N·PTt；

tt基因型頻率Ptt=Pt2；

tt基因型頻數(shù)=N·Ptt；

N為該二倍體個(gè)體總數(shù)。

結(jié) 果

1.Hardy-Weinberg平衡分析：經(jīng)遺傳平衡檢測(cè)，VDR-TaqⅠ兩多態(tài)性位點(diǎn)基因型頻數(shù)在病例組和對(duì)照組人群之間的分布與Hardy-Weinberg定律的理論分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.046，P= 0.83），說明所選取的樣本來自遺傳平衡狀態(tài)的人群。VDR-FokⅠ位點(diǎn)經(jīng)檢測(cè)（χ2=5.166，P= 0.02），可能是由于樣本數(shù)量太小造成（表1）。

表1 對(duì)照組VDR-TaqⅠ、FokⅠ位點(diǎn)基因型分布Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)

2.基因型、等位基因在病例組和對(duì)照組分布：結(jié)果顯示，除VDR-TaqⅠ位點(diǎn)基因型分布在病例組和對(duì)照組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（P＜0.05），其余基因型和等位基因在病例組和對(duì)照組中的分布頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2、3）。

3.基因型模型在病例組和對(duì)照組中的分布：根據(jù)肺結(jié)核的發(fā)生與等位基因顯隱性及基因型純合度的關(guān)系，可將理論上控制表型的VDR-TaqⅠ、FokⅠ位點(diǎn)的基因型分為以下幾類：TaqⅠ位點(diǎn)的堿基T為顯性基因、FokⅠ位點(diǎn)的堿基C為顯性基因，則TaqⅠ、FokⅠ位點(diǎn)基因型可依次分為TT十Tt、tt，F(xiàn)F十Ff、ff兩類；若TaqⅠ位點(diǎn)的堿基T為隱性基因、FokⅠ位點(diǎn)的堿基C為隱性基因，則兩位點(diǎn)基因型可依次分為TT、Tt十tt，F(xiàn)F、Ff十ff；若表現(xiàn)與基因純合度有關(guān)，則兩位點(diǎn)基因型一次分為TT十tt、Tt，F(xiàn)F十ff、Ff兩種基本類型（表4）。

TaqⅠ位點(diǎn)顯性基因模型中，TT十Tt、tt基因型病例組和對(duì)照組分布頻率分別為98.2%（964/982）、1.8%（18/982）和99.4%（867/872）、0.6%（5/872），TT十Tt基因型對(duì)比tt基因型是結(jié)核的保護(hù)因子，OR（95%CI）：0.98（0.978～0.997）；FokⅠ位點(diǎn)純合基因模型中FF十ff、Ff基因型在病例組和對(duì)照組分布頻率分別為52.0%（508/976）、48.0%（468/976）和46.7%（402/861）、53.3%（459/861），F(xiàn)F十ff基因型對(duì)比Ff基因型人群罹患肺結(jié)核的風(fēng)險(xiǎn)增加，OR（95%CI）：1.12（1.023～1.298）。其他基因型模型在病例組和對(duì)照組中分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表4）。

表2 兩組中VDR-TaqⅠ、FokⅠ位點(diǎn)基因型、等位基因的分布

表3 兩組中VDR-TaqⅠ、FokⅠ位點(diǎn)等位基因的分布

表4 基因型模型在病例組和對(duì)照組中的分布

續(xù)表4

4.多因素logistic分析：為排除性別、年齡、民族對(duì)結(jié)果的影響，以是否發(fā)病為因變量，以各種基因模型為自變量，進(jìn)行多因素非條件logistic回歸分析（表5），結(jié)果顯示VDR-（TT十Tt）基因型可能是結(jié)核的保護(hù)因子（OR=0.307，95%CI=0.113～0.833），VDR-（FF十ff）基因型可能是罹患肺結(jié)核的危險(xiǎn)因子（OR=1.242，95%CI=1.031～1.495）（表6）。

表5 不同變量的多因素非條件logistic回歸分析賦值表

表6 多因素logistic分析結(jié)果

討 論

世界衛(wèi)生組織調(diào)查顯示，中國(guó)是結(jié)核第二高發(fā)區(qū)，僅次于印度。為控制肺結(jié)核的疫情，我國(guó)已做過5次全國(guó)范圍內(nèi)的肺結(jié)核流行病學(xué)抽樣調(diào)查。據(jù)2010年調(diào)查顯示，肺結(jié)核防治工作取得顯著成效，全國(guó)肺結(jié)核患病率呈下降趨勢(shì)，但是疫情仍然非常嚴(yán)重［8］。全球約有1/3人口感染結(jié)核分枝桿菌，其中約10%的人最終發(fā)展為結(jié)核病患者［9］，提示感染結(jié)核分枝桿菌后，結(jié)核病的發(fā)生除自身免疫狀態(tài)、環(huán)境因素外，可能還與機(jī)體的遺傳狀態(tài)有關(guān)。目前已發(fā)現(xiàn)的結(jié)核易感基因有HLA和非HLA基因兩大類，在非HLA基因中，VDR基因作為侯選基因受到頗多的關(guān)注。

關(guān)于VDR基因多態(tài)性與結(jié)核易感性的關(guān)聯(lián)性，已有大量國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行過相關(guān)研究，但是研究結(jié)論有較大差異。Wilkinson等［10］對(duì)古吉拉特族人的研究顯示VDR-TT/Tt基因型和VDR-ff基因型合并Vit D缺失是罹患結(jié)核病的危險(xiǎn)因素。Merza等［11］對(duì)伊朗患者、Lombard等［12］對(duì)南非人群的研究顯示，VDR基因多態(tài)性與結(jié)核患病無關(guān)。Lewis等［13］進(jìn)行的Meta分析也顯示該基因多態(tài)性與結(jié)核患病無關(guān)。王喜等［14］研究顯示VDR-TaqⅠ、FokⅠ位點(diǎn)多態(tài)性與新疆維吾爾族人群結(jié)核易患性無關(guān)。李春 柱等［15］針 對(duì) 新 疆 哈 薩 克 族 人 群 研究 顯 示VDR-ff基因型是罹患結(jié)核病的危險(xiǎn)因素，趙真真、Gao等［16-17］的研究也顯示VDR-ff基因型是罹患結(jié)核病的危險(xiǎn)因素。高玉婧等［18］對(duì)寧夏人群的研究顯示FokⅠ位點(diǎn)多態(tài)性與結(jié)核患病無關(guān)。但是，此次針對(duì)寧夏人群的研究顯示，VDR-TaqⅠ、FokⅠ位點(diǎn)多態(tài)性與結(jié)核易感性有關(guān)，在顯性基因模型中，（TT十Tt）基因型可能是結(jié)核的保護(hù)因子，tt基因型可能是罹患結(jié)核病的危險(xiǎn)因素，在純合基因模型中VDR-（FF十ff）基因型可能是結(jié)核的危險(xiǎn)因素，在排除混雜因素后差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與以往研究有差別。

研究結(jié)論不同的原因可能是肺結(jié)核的發(fā)生是由多基因控制的，單個(gè)位點(diǎn)對(duì)其作用不明顯；不同的地區(qū)和民族之間存在差異；受研究條件所限，選取的樣本較少或較片面，可能造成一定程度的結(jié)果差異。關(guān)于VDR基因多態(tài)性與肺結(jié)核發(fā)病之間的真正關(guān)系，該基因與環(huán)境因素、其他易感基因之間的交互作用尚需進(jìn)一步加強(qiáng)研究。

［1］Gibney KB，MacGregor L，Leder K，et al.Vitamin D deficiency is associated with tuberculosis and latent tuberculosis infection in immigrants from sub-Saharan Africa.Clin Infect Dis，2008，46（3）：443-446.

［2］姜彬，陳盛，王元.1，25-二羥維生素D3的免疫學(xué)作用及其臨床應(yīng)用.現(xiàn)代免疫學(xué)，2010，30（1）：85-88.

［3］Anic GM，Thompson RC，Nabors LB，et al.An exploratory analysis of common genetic variants in the vitamin D pathway including genome-wide associated variants in relation to glioma risk and outcome.Cancer Causes Control，2012，23（9）：1443-1449.

［4］李春柱，張萬江.結(jié)核易感基因-VDR基因的研究進(jìn)展.中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2008，24（11）：1060-1062.

［5］李娟，黎友倫.1，25-二羥維生素D3對(duì)結(jié)核桿菌感染的免疫調(diào)節(jié)作用.中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2010，26（11）：1059-1061，1066.

［6］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.WS288-2008肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn).北京：人民衛(wèi)生出版社，2008.

［7］彭翠英，陳琳玲，秦志峰，等.比較全血DNA提取法適用單核苷酸多態(tài)性分析.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2005，15（15）：2293-2295，2298.

［8］全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組，全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查辦公室.2010年全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告.中國(guó)防癆雜志，2012，34（8）：485-508.

［9］Van Leth F，van derWerf MJ，Borgdorff MW.Prevalence of tuberculous infection and incidence of tuberculosis：a re-assessment of the Styblo rule.Bull World Health Organ，2008，86（1）：20-26.

［10］Wilkinson RJ，Llewelyn M，Toossi Z，et al.Influence of vitamin D deficiency and vitamin D receptor polymorphisms on tuberculosis among Gujarati Asians in west London：a case-control study.Lancet，2000，355（9204）：618-621.

［11］Merza M，F(xiàn)arnia P，Anoosheh S，et al.The NRAMPI，VDR and TNF-alpha gene polymorphisms in Iranian tuberculosis patients：the study on host susceptibility.Braz J Infect Dis，2009，13（4）：252-256.

［12］Lombard Z，Dalton DL，Venter PA，et al.Association of HLA-DR，-DQ，and vitamin D receptor alleles and haplotypes with tuberculosis in the Venda of South Africa.Hum Immunol，2006，67（8）：643-654.

［13］Lewis SJ，Baker I，Davey Smith G.Meta-analysis of vitamin D receptor polymorphisms and pulmonary tuberculosis risk.Int Tuberc Lung Dis，2005，9（10）：1174-1177.

［14］王喜，任麗君，吳芳，等.新疆維吾爾族人群結(jié)核病易感基因的多態(tài)性分析.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2011，21（15）：1839-1845.

［15］李春柱，彭杰，韓翠英，等.維生素D受體基因多態(tài)性與新疆哈薩克族結(jié)核病的關(guān)聯(lián)研究.石河子大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，28（3）：330-334.

［16］趙真真，張?zhí)煺埽哂烂鳎?維生素D受體基因多態(tài)性與結(jié)核易感性關(guān)系的薈萃分析.中華結(jié)核和呼吸雜志，2009，32（10）：748-751.

［17］Gao L，Tao Y，Zhang L，et al.Vitamin D receptor genetic polymorphisms and tuberculosis：updated systematic review and meta-analysis.Int J Tuberc Lung Dis，2010，14（1）：15-23.

［18］高玉婧，裴秀英，楊華，等.維生素D受體基因多態(tài)性與寧夏結(jié)核病遺傳易感性的關(guān)聯(lián)性研究.寧夏醫(yī)學(xué)雜志，2008，30 （8）：673-676.

Genetic polymorphisms in VDR-Taq I and VDR-Fok I and susceptibility to tuberculosis among different populations in Ningxia,Peoples'Republic of China

CHEN Dan-dan*，ZHU Gui-na，GUAN Guang-yu，Magda Ellis，Donald P.McManus，YANG Yu-rong.*Human Pathogen and Immunology Department，Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，China

YANG Yu-rong，Email：yangyurong@hotmail.com

Objective This study aimed to explore the relationship between SNP polymorphisms in TaqⅠand FokⅠin the Vitamin D Receptor（VDR）gene and susceptibility to pulmonary tuberculosis（PTB）among the populations in Ningxia Hui Autonomous Region（NHAR），P.R.of China.Methods The confirmed 993 PTB cases（550 males and 443 females）were recruited in different TB clinics of southern NHARin 2010，who had been diagnosed according to WHO TB-diagnosis criteria，without any other co-infections.The 880 healthy matched controls，including 485 males and 395 females were recruited to match the sex，nationality，age and residential area of the TB cases.The detection of two SNPs（TaqⅠ，F(xiàn)okⅠ）in the VDR gene was demonstrated by use of polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP）analysis.All data were entered into the SPSS 16.0 software package.The population data were tested by the Hardy-Weinberg method and then multiple logistic regression models were used for further investigation of the risk gene SNPs in different genetic models，and included covariates that had shown association with disease in the univariate analysis.The significance value was de-termined within 95%confidential intervals with P＜0.05.Results The genotype frequencies of VDR-TT，Tt and tt were 83.0%（815/982），15.2%（149/982），1.8%（18/982）and 84.7%（739/872），14.7%（128/872），0.6% （5/872）in the case and control groups，respectively，with significant difference（χ2=6.15，P=0.046）.The genotype frequencies of VDR-FF，F(xiàn)f and ff were 32.4%（316/976），47.9%（468/976），19.7%（192/976）and 28.5% （245/861），53.3%（459/861），18.2%（157/861）in the case and control groups，respectively，without any significant differences between the case and control groups.The genotype frequencies in the dominant model of VDR-（TT十Tt），tt were 98.2%（964/982），1.8%（18/982）and 99.4%（867/872），0.6（5/872）in the case and control groups with significantly different value（χ2=5.98，P=0.014）and an OR（95%CI s）of 0.98，3.19（0.978-0.997，1.193-8.574）.The genotype frequencies in the heterozygote model of VDR-（FF十ff），F(xiàn)f were 52.0% （508/976），48.0%（468/976）and 46.7%（402/861），53.3%（459/861）in cases and controls，with significant value（χ2=5.27，P=0.022）and an OR（95%CI s）of 1.12，3.19（1.023-1.298，0.822-0.985）.Conclusion The VDR TaqⅠand FokⅠpolymorphism was associated with susceptibility to human pulmonary tuberculosis amongst Ningxia Populations.The genotype of the VDR-（FF十ff），tt showed a potential association with risk factors to human pulmonary tuberculosis in the study population groups.The genotypes of the VDR-（TT十Tt）and Ff may be associated with increased resistance to disease.

Tuberculosis，pulmonary/genetics； Receptors，calcitriol； Polymorphism，single nucleotide；Genetic predisposition to disease； Case-control studies； Ningxia

2013-04-24）

（本文編輯：張曉進(jìn)）

NHMRC（National Health Medical Research Councils，APP1025166）

750004銀川，寧夏醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)與免疫學(xué)系［陳丹丹（研究生）、朱圭娜（研究生）、楊玉榮］；寧夏疾病預(yù)防控制中心研究所（關(guān)光玉）；澳大利亞新南威爾士州結(jié)核研究所（Magda Ellis）；澳大利亞昆士蘭醫(yī)學(xué)研究所傳染病研究部（Donald P.McManus）

楊玉榮，Email：yangyurong@hotmail.com