熱滅活和紫外線照射滅活結核分枝桿菌的實驗效果分析

賴賽麟 李海成 王威 孫毅凡 郭卉欣 陳濤 江勇 錢明 江振友 周琳 鐘球

·短篇 論著·

熱滅活和紫外線照射滅活結核分枝桿菌的實驗效果分析

賴賽麟 李海成 王威 孫毅凡 郭卉欣 陳濤 江勇 錢明 江振友 周琳 鐘球

我國衛生部公布的《人間傳染的病原微生物名錄》中結核分枝桿菌被列為第二類病原微生物（危害程度為Ⅲ級），屬高致病性病原微生物［1］。實驗室研究課題中，大部分涉及到結核分枝桿菌的操作，實驗室生物安全是首先要解決的問題。至今，已有一些關于實驗室工作人員患結核病的報道，其中呼吸道吸入感染是實驗室感染的最主要類型［2］。根據傳染病發生必須存在的3個條件：傳染源、傳播途徑和易感者。在實驗操作中如果做好傳染源的控制，如避免產生活菌氣溶膠、有效滅活細菌等，實驗室生物安全就有了最根本的保障。本實驗探討了實驗室結核分枝桿菌傳染源控制中的熱滅活和紫外線照射滅活方法的效果，為保障生物安全提供參考依據。

材料和方法

一、實驗材料

1.實驗菌株：6株結核分枝桿菌：BCG：牛結核分枝桿菌；H37Ra：結核分枝桿菌減毒株；H37Rv：結核分枝桿菌標準株；Se：臨床分離敏感菌株；MDR：臨床分離耐多藥菌株；XDR：臨床分離廣泛耐藥菌株。上述菌株均由廣東省結核病控制中心提供，均已經過對硝基苯甲酸（PNB）、噻吩-2-羧酸肼（TCH）鑒別培養基進行菌群初篩鑒定為結核分枝桿菌，并經過了基因分型鑒定和藥敏鑒定為相應菌株。

2.改良羅氏固體培養基：由廣東省結核病控制中心制作提供。

3.比濁儀：法國bioMérieux（生物梅里埃）公司生產的DensiCHEK Plus比濁儀。

4.生物安全柜：新加坡Esco公司生產的Labculture 2級生物安全柜。

5.電熱儀：杭州奧盛儀器有限公司生產的干式恒溫器。

6.紫外線燈：新加坡Esco Labculture 2級生物安全柜內置30 W紫外線燈，距離工作臺面約70 cm，壽命在有效期內，使用前已用75%乙醇紗布擦拭清潔。

7.37 ℃培養箱：上海一恒科技有限公司生產的LRH系列生化培養箱。

二、實驗方法

1.制備菌懸液：6株細菌已在改良羅氏培養基培養5周，用接種環分別刮取菌株純培養物至6個磨菌器中，用巴氏管加入無菌10%吐溫-80的水溶液3滴，研磨后加入無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋，轉移至一塑料試管經比濁儀測量，根據讀數稀釋為100mg/ml，其余兩個濃度為10-1mg/ml、10-2mg/ml菌懸液在此基礎上依次加PBS稀釋制備。

2.加熱滅活：實驗在Esco Labculture 2級生物安全柜中操作。吸取菌懸液1 ml至有螺紋蓋的2 ml離心管（EP管）中，轉移至已設好溫度的電熱儀孔中，加熱至不同時間取出，立即將處理后的菌懸液用10μl標準接種環各接種3環到2個改良羅氏固體培養基斜面，設立PBS陰性對照，培養基空白對照和各菌懸液陽性對照，放37℃培養箱培養8周，實驗按菌液濃度分批進行。

3.紫外線照射滅活：實驗在Esco Labculture 2級生物安全柜中操作，BSL-2負壓實驗室內的溫度為22℃，相對濕度為24%。吸取各菌株的菌懸液各1 ml至6孔培養板，開蓋置安全柜內置的紫外線燈下，垂直距離70 cm，照射至不同時間終止照射，將照射后的菌懸液用10μl標準接種環各接種3環到2支改良羅氏固體培養基斜面，設立PBS陰性對照，培養基空白對照和各菌懸液陽性對照，放37℃培養箱培養8周，實驗按菌液濃度分批進行。

4.結果觀察記錄：在經滅活處理后培養的第4周，觀察記錄培養基斜面的殘存菌落生長情況，第8周觀察記錄陰性結果：（1）無菌落生長記錄為“-”。（2）菌落數≤50個記錄實際菌落數。（3）菌落數＞50個，生長面積≤1/4記錄為“十”；1/4＜生長面積≤1/2記錄為“十十”；1/2＜生長面積≤3/4記錄為“十十十”；生長面積＞3/4記錄為“十十十十”［3］。記錄結果為2支羅氏培養基表面生長菌落的平均值。

結 果

一、熱滅活

6株菌株3個菌液濃度的陽性對照均有大量菌落生長，PBS陰性對照及羅氏培養基空白對照均沒有菌落生長。在加熱溫度、時間相同的條件下，隨著滅活對象菌懸液濃度的增大，細菌的殘存數呈增多趨勢；在菌液濃度、加熱時間相同的情況下，隨著加熱溫度的增大，細菌的殘存數呈減少趨勢；在菌液濃度、加熱溫度相同的條件下，隨著加熱時間的增加，細菌的殘存數呈減少趨勢。在溫度≥80℃，加熱時間≥10 min的條件下，6株菌株10-2、10-1、100mg/ml 3個濃度1 ml菌懸液里的細菌可以被有效滅活（表1）。

表1 不同加熱時間各菌株10-2、10-1、100mg/ml 3個菌液濃度1 ml菌懸液經不同溫度熱滅活的結果

二、紫外線照射滅活

6株菌株3個菌液濃度的陽性對照均有大量菌落生長，PBS陰性對照及羅氏培養基空白對照均沒有菌落生長。在紫外線照射距離、照射時間相同的條件下，隨著菌液濃度的增大，細菌的殘存數呈增加的趨勢；在紫外線照射距離、菌液濃度相同的條件下，隨著照射時間的增加，細菌的殘存數呈減少的趨勢；在照射距離為70 cm，照射時間≥40 min的條件下，6株菌株10-2、10-1、100mg/ml 3個菌液濃度1 ml菌懸液里的細菌可以被紫外線有效滅活（表2）。

表2 不同菌株10-2、10-1、100mg/ml 3種菌液濃度1 ml菌懸液經紫外線照射的滅活結果

討 論

首先，本滅活實驗研究中同時設立的6株菌株3個菌液濃度的陽性對照均有大量菌落生長，PBS陰性對照及羅氏培養基空白對照均沒有菌落生長，保證了實驗結果準確地反映滅活處理的效果。

一、關于影響熱滅活結核分枝桿菌效果的因素分析

在針對結核分枝桿菌的分子生物學水平的實驗操作前，如菌種分子鑒定、基因分型及耐藥基因分析等，必須先對培養物或臨床樣本進行確切滅活。目前的滅活方法主要是熱滅活法，但溫度和時間各不相同，最常見的方案是80℃，滅菌30 min［3］，但也有文獻指出這個簡單的80℃滅活方案的重復性依然有爭議［4］。本次熱滅活實驗設計了溫度梯度、時間梯度和菌液濃度梯度進行了探討，從表1的結果數據來看，80℃滅活方案的有效性得到了支持。但是在60℃、70℃滅活方案中，在加熱溫度、時間相同的條件下，隨著滅活對象菌懸液濃度的增大，細菌的殘存數呈增多趨勢。因此，必須考慮到菌液濃度因素的影響，如果菌液濃度繼續增大，甚至遠超出本次實驗100mg/ml的范圍，80℃的滅活方案是否也會出現殘存的活菌？這是個值得進一步研究的問題，可能也是80℃滅活方案還具有爭議性的問題所在。另一方面，從表1還可以看到：在菌液濃度、加熱時間相同的情況下，隨著加熱溫度的增大，細菌的殘存數呈減少趨勢；在菌液濃度、加熱溫度相同的條件下，隨著加熱時間的增加，細菌的殘存數呈減少趨勢。所以，筆者建議：在不影響后續分子生物學實驗的前提下，宜提高滅活溫度或者延長滅活時間，以最大程度地降低生物安全風險。

二、關于影響紫外線照射滅活結核分枝桿菌效果的因素分析

本次紫外線照射滅活實驗只設計了時間梯度和菌液濃度梯度，解讀表2結果數據，滅活效果影響因素跟熱滅活實驗有相似之處：延長作用時間會增強滅活效果，菌液濃度的增大會減弱滅活效果。紫外線消毒有一個特別需要注意的特點是紫外線的穿透力弱，任何可以阻擋紫外線穿透的東西都會減弱滅活效果，如空氣濕度、菌液厚度，等等。因此，生物安全柜每次紫外線消毒前應先用能有效殺滅結核分枝桿菌的75%乙醇擦拭污染的工作臺面，雙管齊下，以最大程度地滅活污染臺面的活菌。另外，根據大量文獻報道，用紫外線對物體表面進行消毒時，燈管距物體表面的距離一般不超過1 m，照射時間一般不少于30 min［5］。本次實驗在照射距離為0.7 m的條件下，照射時間達到40 min才能檢測不出殘存的活菌，與文獻報道相似。

其實，紫外線對結核分枝桿菌的殺菌效能，周維新［6］早有研究。結核分枝桿菌對紫外線敏感，室內空氣和物體表面可直接照射部分，紫外線消毒效果肯定有效［3］。使用紫外線滅菌裝置進行物品表面消毒時，燈管距離物體表面不得超過1 m，應使照射表面受到紫外線的直接照射，且應達到足夠的照射劑量，使用中燈管的照射強度不得低于70μW/cm2；使用紫外線滅菌裝置進行室內空氣消毒時，房間內應保持清潔干燥，溫度低于20℃或高于40℃，相對濕度大于60%時應適當延長照射時間［7］。消毒效果與距離成反向線性關系［8］。

因為結核分枝桿菌是高致病性、可以經呼吸道傳染的病原微生物，對實驗人員的健康構成嚴重威脅。本次紫外滅活實驗只能模擬物體表面受菌液污染，局限于用生物安全柜內置的紫外線燈進行。燈管離工作臺面垂直照射距離約70 cm，故不能設計更長的照射距離，亦不能設計氣溶膠滅活實驗，這是本次實驗的局限。

［1］劉國傳，劉來福，張利峰，等.檢驗檢疫病原微生物實驗室的生物安全.檢驗檢疫學刊，2009，19（3）：50-52.

［2］陸兵，劉秋煥，王榮，等.結核分枝桿菌實驗室獲得性感染事件分析.中國防癆雜志，2012，34（5）：333-335.

［3］陳明亭，萬康林.結核病實驗室技術手冊.北京：科學出版社，2011.

［4］Zwadyk P Jr，Down JA，Myers N，et al.Rendering of mycobacteria safe for molecular diagnostic studies and development of a lysis method for strand displacement amplification and PCR.J Clin Microbiol，1994，32（9）：2140-2146.

［5］謝立新，金玉懷，張永紅，等.影響紫外線殺菌的因素分析.華北煤炭醫學院學報，2005，7（3）：372-373.

［6］閻邦首.紫外線對結核菌的殺菌效能.中國防癆雜志，1964，5 （2）：409-411.

［7］王黎霞，成詩明，何廣學，等.中國結核感染控制標準操作程序.北京：人民衛生出版社，2012.

［8］周維新.紫外線輻射強度與電壓和距離的關系.中國消毒學雜志，1991，10（4）：237-238.

（本文編輯：薛愛華）

國家“十二五”科技重大專項（2012ZX10004903；2013ZX10003001）

510630廣州，暨南大學醫學院微生物與免疫教研室（賴賽麟、孫毅凡、江振友）；廣東省結核病控制中心 廣東省“十二五”結核病防治轉化醫學重點實驗室（李海成、郭卉欣、陳濤、江勇、錢明、周琳、鐘球）；廣東省佛山市第四人民醫院檢驗科（王威）

鐘球，Email：zhongqiu@vip.163.com

2013-06-06）