169例女性宮頸病變組織HPV基因分型檢測(cè)結(jié)果分析

張曉燕，余 琦，李 寧＊

（1.河北北方學(xué)院，河北 張家口 075000；2.解放軍總參謀部總醫(yī)院（309醫(yī)院）病理科，北京 100091）

169例女性宮頸病變組織HPV基因分型檢測(cè)結(jié)果分析

張曉燕1，余 琦2，李 寧2＊

（1.河北北方學(xué)院，河北 張家口 075000；2.解放軍總參謀部總醫(yī)院（309醫(yī)院）病理科，北京 100091）

＊通訊作者

宮頸癌是女性常見(jiàn)惡性腫瘤，嚴(yán)重危害婦女健康，其中人類(lèi)乳頭瘤病毒（HPV）基因型與宮頸癌關(guān)系最為密切。準(zhǔn)確高效的HPV分型檢測(cè)方法，對(duì)于女性宮頸病變患者的健康顯得尤為重要。本研究對(duì)169例女性宮頸病變患者進(jìn)行HPV感染基因分型檢測(cè)，采用表面等離子諧振法檢測(cè)HPV不同基因亞型，探討HPV-DNA基因分型和不同宮頸病變的關(guān)系，對(duì)宮頸病變的早期診斷、預(yù)后判斷、治療后的隨訪監(jiān)測(cè)及宮頸癌疫苗的研發(fā)都有重要意義。

1 材料與方法

1.1 資料

1.1.1 病例來(lái)源：收集2010年10月至2011年11月于解放軍第309醫(yī)院婦科門(mén)診就731例患者中選取宮頸活檢組織169例，年齡20-64歲，平均39.0歲。按組織學(xué)病理分類(lèi)：慢性宮頸炎103例，宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）48例，宮頸鱗狀細(xì)胞癌（SCC）18例。

1.1.2 儀器及試劑：W2600型生物傳感芯片閱讀儀（北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司），表面等離子諧振法檢測(cè)試劑盒（其中芯片為柱面鏡）。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取純化：取石蠟切片放入1.5ml離心管中，加入20μl裂解液，95℃水浴10min融化石蠟。在石蠟?zāi)糖埃?2 000rpm離心2min，分離溶液和石蠟。加模板前12 000rpm離心2min，上部為石蠟層，取下部的水相做PCR模板。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 ① 按照擴(kuò)增混合液89μl和Taq酶1μl的比例配置PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)體系為100 μl，按照計(jì)算得出的數(shù)量，取擴(kuò)增混合液和Taq酶，在無(wú)菌離心管內(nèi)渦旋振蕩15s使其混勻，并瞬時(shí)數(shù)秒。按每管90μl分裝到無(wú)菌的擴(kuò)增管中，并分別做好樣本和陽(yáng)性對(duì)照流池內(nèi)控品的標(biāo)記。② 按照標(biāo)記，向各個(gè)PCR擴(kuò)增中加入5μl對(duì)應(yīng)的樣本DNA。蓋蓋后輕彈管壁使其混勻，瞬時(shí)離心數(shù)秒使液體全部收集到PCR管底部。③將已經(jīng)配好的PCR擴(kuò)增體系放入合適的PCR擴(kuò)增儀中，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.3 進(jìn)行雜交 將擴(kuò)增產(chǎn)物瞬時(shí)離心使液體收集管底，向每管樣本擴(kuò)增產(chǎn)物中加入20μl陽(yáng)性對(duì)照池內(nèi)控品擴(kuò)增產(chǎn)物和60μl雜交緩沖液，渦10s混勻，置水浴鍋中95℃變性3-5min，之后嚴(yán)格按照SPR檢測(cè)系統(tǒng)操作即可。

1.2.4 判定標(biāo)準(zhǔn)

SPR檢測(cè)系統(tǒng)顯示：①結(jié)果有效：陽(yáng)性對(duì)照流池的信號(hào)值≥40mo，陰性對(duì)照流池信號(hào)值＜40mo，則可認(rèn)定為結(jié)果有效。②結(jié)果無(wú)效：陽(yáng)性對(duì)照流池的信號(hào)值＜40mo，或者陰性對(duì)照流池信號(hào)值≥40 mo，則可認(rèn)定為結(jié)果無(wú)效。③分型探針檢測(cè)陽(yáng)性：探針的信號(hào)值≥40mo；④分型探針檢測(cè)陰性：探針的信號(hào)值＜4 0mo；

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法SPSS 17.0軟件包建立數(shù)據(jù)庫(kù)，采用χ2檢驗(yàn)，陽(yáng)性例數(shù)少于5例自動(dòng)修正為Fisher精確檢驗(yàn)，雙側(cè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 宮頸病變與HPV感染情況

在被檢查的169名婦科就診患者中，HPV陽(yáng)性者69例，總陽(yáng)性率為40.8%；慢性宮頸炎103例，陽(yáng)性率為20.4%；CIN（包括CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ）48例，陽(yáng)性率為66.7%；宮頸鱗狀細(xì)胞癌 （SCC）18例，陽(yáng)性率為88.9%。隨宮頸病變的逐漸升級(jí)，HPV感染率呈升高趨勢(shì)。CIN，宮頸鱗狀細(xì)胞癌，慢性宮頸炎三組相比，（χ2＝48.287，P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)表1）。

表1 宮頸病變與HPV感染情況比較

2.2 HPV感染與年齡分布

169名宮頸病變患者分成4個(gè)年齡段，從表2中可以看出30-40年齡組陽(yáng)性率（51.1%）最高。對(duì)各組陽(yáng)性率進(jìn)行檢驗(yàn)（χ2＝4.346，P＞0.05），提示感染者的年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 HPV感染的基因亞型分布見(jiàn)表3。HPV單亞型與多重感染病例亞型分布見(jiàn)表4。

表2 169例女性患者的年齡分布和HPV陽(yáng)性率

表3 69例HPV陽(yáng)性者HPV亞型的分布

從表3中可看出高危HPV基因型HPV16、HPV51、HPV45、HPV58感染率較高，感染低危基因型有 HPV6、HPV11（低危型均在宮頸慢性炎組）。在HPV陽(yáng)性組織69例中低危3例（4.3%），高危型感染66例（95.7%），其中單亞型感染51例（81.2%），多重型感染18例（18.8%，均為高危混合型），見(jiàn)表4。

表4 HPV單亞型與多重感染病例亞型的分布情況

3 討論

宮頸癌被認(rèn)為是第二個(gè)最常見(jiàn)的婦女癌癥，尤其是在發(fā)展中國(guó)家［1］。從全球來(lái)看，宮頸癌的發(fā)病率約為50萬(wàn)例，每年有50%的病死率。亞洲國(guó)家患病率為54%并且有關(guān)的死亡人數(shù)的80%發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家，預(yù)計(jì)到2020年將增加至90%［2］。分子流行病學(xué)已證實(shí)，HPV的持續(xù)感染是導(dǎo)致子宮頸癌的必要條件.目前，超過(guò)90種不同HPV基因型已經(jīng)確定。在高度鱗狀上皮內(nèi)病變（HSILs）和浸潤(rùn)性宮頸癌組織中已經(jīng)證實(shí)，基因型HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和66為高危型；基因型HPV6和HPV11視為是低危型［3］。在不同的流行病學(xué)研究中，低危型HPV6、HPV11通常與生殖器尖銳濕疣有關(guān)；而高級(jí)別的宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變常常感染HPV16、HPV18、HPV45、HPV31基因型［4］。然而，宮頸HPV感染類(lèi)型是可變的，持續(xù)的感染，久而久之就會(huì)改變［5］。本研究表明，CIN組與SCC組HPV感染均為高危型感染，其中HPV16、HPV51感染率較高，且兩組的多重感染率亦高。所謂HPV的多重感染或稱(chēng)重疊感染，是指在某一個(gè)體或某一種病變中感染或檢測(cè)到兩種或兩種以上的HPV亞型。已有研究表明，婦女宮頸HPV的多重感染率波動(dòng)于2%-71%，最多見(jiàn)的報(bào)道是10%-20%［6］.Lee等人［7］報(bào)道，單一的 HPV 基因型感染使宮頸癌的患病風(fēng)險(xiǎn)增加19.9倍，而多重HPV基因型感染使風(fēng)險(xiǎn)增加到31.8倍，表明HPV多重感染增加了宮頸癌患病率。然而，在Sasagawa等［8］報(bào)道中，多重 HPV基因型感染的平均比值（OR值）低度鱗狀上皮內(nèi)病變?yōu)?4，HSILs為16，宮頸癌為8.3，隨著宮頸疾病的加重多重感染率反而有所下降。這說(shuō)明，多重HPV感染和宮頸癌的發(fā)病之間的關(guān)聯(lián)問(wèn)題可能要等待進(jìn)一步的大規(guī)模研究。

近年來(lái)在我國(guó)的宮頸癌發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，發(fā)病年齡也趨于年輕化，HPV感染也越發(fā)年輕化。大多數(shù)患者初次感染HPV無(wú)任何癥狀出現(xiàn)，一般無(wú)須治療，不超過(guò)2年就會(huì)自行消失。然而，在一些婦女中，HPV感染有時(shí)會(huì)持續(xù)多年，并可能會(huì)增加宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)［9］.本研究表明，在不同的年齡段中，30-40歲HPV感染率最高，這可能與多性伴侶，吸煙和長(zhǎng)期使用口服避孕藥以及其他性傳播疾病有關(guān)［10，11］。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用等離子諧振技術(shù)（SPR）檢測(cè)24種HPV基因型，包括16種高危型（16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、81）和 8種低危型（6、11、40、42、43、44、54、70）。首先從待測(cè)樣品中提取基因組，采用聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （PCR）擴(kuò)增待測(cè)樣品中HPV基因片段，將PCR產(chǎn)物與雜交液按一定比例混合后，注入SPR生物傳感芯片閱讀儀，使其流過(guò)表面包被有24種HPV基因型特異性探針的SPR生物傳感芯片，與芯片表面HPV基因型特異探針?lè)磻?yīng)，芯片閱讀儀利用金屬膜／液面界面，由光發(fā)射引起的物理光學(xué)現(xiàn)象來(lái)分析分子間相互作用原理來(lái)檢測(cè)芯片上的雜交信號(hào)，數(shù)據(jù)通過(guò)軟件分析可直接判斷結(jié)果，從而同時(shí)對(duì)HPV的24種基因型進(jìn)行檢測(cè)。SPR一次檢測(cè)就可能判斷某一基因座位的大部分或全部等位基因，此技術(shù)在HPV混合感染的檢測(cè)中更具優(yōu)勢(shì)，能檢測(cè)出較多的型別和某些少見(jiàn)的HPV型別，可作為篩查檢測(cè)工具。不僅可用于分型，而且可以對(duì)多個(gè)型別的混合感染同時(shí)進(jìn)行監(jiān)控，較雜交捕獲法更有優(yōu)勢(shì)。靈敏度和特異性相對(duì)其他方法較高，其敏感性高于細(xì)胞學(xué)。檢測(cè)結(jié)果客觀性強(qiáng)，運(yùn)用計(jì)算機(jī)軟件對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)行掃描分析和數(shù)據(jù)處理，減少了分析時(shí)間。

綜上所述，持續(xù)的高危型HPV感染是宮頸癌發(fā)生的必要條件和首要因素。利用表面等離子諧振法（SPR）對(duì) HPV 進(jìn)行檢測(cè)和分型，并進(jìn)一步對(duì)HPV各亞型的分布有所了解，有助于指導(dǎo)女性宮頸癌的預(yù)防、篩查、疫苗研究及宮頸癌的早期診斷，達(dá)到降低宮頸癌發(fā)生率的目的。

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