氯化鎘暴露對斑馬魚幼魚神經(jīng)行為毒性作用

史慧勤，張利軍，苑曉燕，彭輝，趙君，彭雙清

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)防控制所毒理學(xué)評價研究中心，北京100071

鎘是一種重要的環(huán)境重金屬污染物，由吸入含鎘的煙霧和灰塵引起急性鎘中毒歷來是危害公共衛(wèi)生安全的重要事件，而對食品安全問題的擔(dān)憂使得人們更加重視水源、可食水生生物以及農(nóng)作物中鎘污染的問題。鎘具有蓄積性，可造成肝、腎、骨骼等全身多臟器的損傷［1-2］，并且可透過胎盤影響胎兒，因而對出生前后低劑量鎘暴露引起的發(fā)育障礙尤其是對胎兒和嬰幼兒神經(jīng)發(fā)育方面影響也廣受關(guān)注。臨床研究認(rèn)為，胎兒期慢性鎘暴露能夠抑制神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育并引起嬰幼兒認(rèn)知功能障礙以及感覺運動能力減弱、多動癥和注意力障礙等［3-5］。兒童期體內(nèi)鎘負(fù)荷量增高可造成精神運動性發(fā)育障礙，損害感知覺能力、語言能力并造成智力下降［3-4］。嚙齒動物實驗結(jié)果表明，出生前后低水平的鎘暴露會影響小鼠電生理學(xué)功能和高級神經(jīng)系統(tǒng)功能［6］。另外，低劑量長期染毒會減少海馬CA3區(qū)神經(jīng)元和反應(yīng)性增多星型神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)、記憶能力降低［7］。小鼠胎仔宮內(nèi)鎘暴露后，出現(xiàn)劑量依賴性的獲得性條件回避反射能力損害及異常行為表現(xiàn)，并在發(fā)育至成年后具有遠(yuǎn)期行為損害效應(yīng)［8-9］。

斑馬魚具有典型的脊椎動物腦部形態(tài)特征，并且分子遺傳學(xué)和發(fā)育生物學(xué)背景明確，已被廣泛應(yīng)用于毒理學(xué)神經(jīng)發(fā)育研究［10］。Chow 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)育早期鎘暴露能夠抑制斑馬魚胚胎的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化，導(dǎo)致胚胎頭部發(fā)育不良，神經(jīng)前體基因表達(dá)降低，進(jìn)而證實鎘通過損害斑馬魚神經(jīng)細(xì)胞生成，導(dǎo)致神經(jīng)分化顯著降低和軸突形成減少來發(fā)揮神經(jīng)發(fā)育毒性作用。斑馬魚的神經(jīng)組織和器官結(jié)構(gòu)雖然簡單但能夠支配復(fù)雜行為活動，如逃避、捕食、群體交互及學(xué)習(xí)、記憶等［12-13］。本實驗檢測了發(fā)育早期階段經(jīng)過低劑量鎘長時間暴露的斑馬魚幼魚的運動行為特征，目的是為探索應(yīng)用高通量的神經(jīng)行為學(xué)方法檢測水環(huán)境中鎘污染和提高斑馬魚幼魚作為神經(jīng)發(fā)育毒理學(xué)模型的應(yīng)用效能提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法(M aterials and methods)

1．1 主要試劑及配制

氯化鎘(cadmium chloride)(99．0%)，北京化工廠。幼魚孵化液(30%Danieau＇s 液):17．4 mmol·L-1NaCl、0．21 mmol·L-1KCl、0．12 mmol·L-1MgSO4、0．15 mmol·L-1Ca(NO3)2、1．5mmol·L-1Hepes(pH 7．2)。參照文獻(xiàn)［11，14］，用幼魚孵化液配制0．5 ～2．0 μmol·L-1的氯化鎘受試液和0．5% ～4%乙醇溶液。亞甲基藍(lán)，溫州市化學(xué)試劑有限公司，先用滅菌水配制0．1%母液，使用時稀釋500倍。

1．2 動物飼養(yǎng)和魚卵采集

斑馬魚親魚為AB系，由北京大學(xué)生命科學(xué)研究院惠贈。斑馬魚的養(yǎng)殖和繁殖參照Westerfield的方法［15］。光照周期 L∶D=14 h∶10 h，水溫(28±1)℃，養(yǎng)魚系統(tǒng)循環(huán)水為去離子水加海鹽，保持電導(dǎo)率450～500 μs·cm-1，用 NaHCO3調(diào)節(jié) pH 值為7．0左右。使用新鮮孵化的豐年蝦喂養(yǎng)，一日2次。5月齡后雌雄魚分箱飼養(yǎng)。

實驗前1天晚間將7～18月齡成魚放入交配缸(雌∶雄=1∶1)。次日清晨取隔板后，采集30 min內(nèi)產(chǎn)受精卵，用循環(huán)水清洗2遍后放入孵化液中，同時加入亞甲基藍(lán)溶液防止真菌產(chǎn)生，于28．5℃繼續(xù)孵化。受精后2 h(2 hpf)體式顯微鏡下觀察，確定發(fā)育階段［16］并選擇正常受精卵備用。

1．3 實驗儀器

Noldus幼魚運動行為儀(Noldus Information Technology，美國);體式顯微鏡及成像系統(tǒng)(OLYMPUS SZX16，日本);電子天平(Sartorius BT224S和LP1200S，德國)。

1．4 行為學(xué)實驗準(zhǔn)備和受試液處理

將收集36 hpf斑馬魚胚胎置于6孔板中，約60枚/孔。吸凈孵化水后迅速加入5 mL氯化鎘受試溶液，每孔一個劑量濃度。給藥后放入28．5℃孵箱中繼續(xù)孵化。及時取出死亡魚卵或幼魚。至6 dpf前每日更換2次受試液，每次更換2．5mL。實驗同時設(shè)正常對照組，每日更換新鮮孵化水。6 dpf時在體式顯微鏡下觀察記錄幼魚的形態(tài)變化，記錄死亡和畸形情況以及畸形特征。選擇96 hpf死亡率和畸形率＜5%的劑量組幼魚作為實驗用魚。將外觀正常的幼魚逐條放入潔凈48孔板中，24條/劑量組。每孔保持1 mL受試液。乙醇處理方法:將5 mL不同濃度乙醇溶液分別放入潔凈6孔板中，1劑量組/孔。用小濾勺將正常對照6 dpf幼魚迅速移至6孔板中，60條/劑量組。然后逐條轉(zhuǎn)移幼魚至48孔板中，24條/劑量組。每孔1 mL受試液。同時設(shè)立正常對照。

1．5 幼魚自發(fā)運動觀察

將48孔板放入Noldus幼魚運動行為儀內(nèi)適應(yīng)5 min。采集3 min幼魚自發(fā)運動視頻。應(yīng)用Ethovision XT軟件(Noldus Information Technology)將運動軌跡可視化，導(dǎo)出3 min內(nèi)幼魚移動距離、運動速度等運動參數(shù)。乙醇暴露組的實驗時間為:4%組為暴露后30 min;1%、2%組為暴露后45 min;0．5%組為暴露后1 h。實驗同時設(shè)正常對照。實驗時段為12:30—15:30，接近幼魚運動平臺期［14］。

1．6 幼魚對強光刺激的驚恐逃避反射實驗

將48孔板放入Noldus幼魚運動行為儀內(nèi)適應(yīng)5 min后，控制Noldus幼魚運動行為儀采集11 min幼魚運動視頻，其中前5 min為黑暗期，第6 min通過Ethovision XT軟件編程控制行為儀開啟底燈強光照射1 min后迅速關(guān)閉。應(yīng)用Ethovision XT軟件導(dǎo)出每分鐘幼魚運動速度、移動距離等參數(shù)。實驗同時設(shè)正常對照。實驗時段為12:30—15:30。

1．7 結(jié)果統(tǒng)計和分析

將運動參數(shù)按劑量組整理匯總，用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差(Mean±SD)表示。應(yīng)用軟件SPSS11．5進(jìn)行單因素One-Way方差分析，即在方差齊性檢驗的基礎(chǔ)上分別采用LSD(方差齊時)或Tamhane(方差不齊時)檢驗，比較正常對照組和各劑量組間運動參數(shù)差異，當(dāng)P＜0．05時，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果(Results)

在36 hpf～6 dpf期限內(nèi)鎘暴露組幼魚死亡率畸形率均低于5%。體式顯微鏡下觀察可見，暴露劑量≤1．0 μmol·L-1時，除個別幼魚體色變淺外，外觀形態(tài)未見明顯異常，可用于行為學(xué)實驗。

2．1 低劑量氯化鎘暴露對斑馬魚幼魚自發(fā)運動的影響

將6 dpf幼魚的自發(fā)運動軌跡可視化，結(jié)果顯示:與正常對照相比，0．1 ～0．5 μmol·L-1暴露組幼魚運動自發(fā)運動軌跡增多、紊亂，并伴有刻板式轉(zhuǎn)向活動增多，觸壁反射活動減少;而0．5 ～1．0 μmol·L-1暴露組幼魚出現(xiàn)僵直、震顫和小范圍內(nèi)轉(zhuǎn)圈現(xiàn)象，以1．0μmol·L-1組更為明顯(見圖1)。以上結(jié)果表明，胚胎期和幼魚早期階段持續(xù)性氯化鎘暴露能夠改變幼魚的運動方式。

圖1 36 hpf～6 dp f氯化鎘暴露后6 dpf幼魚運動軌跡

自發(fā)運動參數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，在0．1 ～1．0 μmol·L-1范圍內(nèi)隨暴露劑量增大，幼魚自發(fā)運動距離由增高轉(zhuǎn)向降低，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性倒“U”型反應(yīng)趨勢(圖2A)，而由于 0．25 ～1．0 μmol·L-1暴露組幼魚增快和減慢2種運動并存，因而平均速度值沒有顯著性差異(圖2B)，通過最大移動速度、快速運動(速度≥2．0 cm·s-1)持續(xù)時間及出現(xiàn)頻率比較(圖2C、2D、2E)，發(fā)現(xiàn)雖然組內(nèi)參數(shù)差異較大，但各劑量組依然從一定程度上能夠反映組間倒“U”型毒性效應(yīng)，這與實驗中乙醇暴露后幼魚產(chǎn)生的倒“U”型運動效應(yīng)相類似，即0．5% ～2%乙醇較長時程暴露具有運動興奮效應(yīng)，而4%乙醇較短時程暴露則具有明顯的抑制作用(見圖3)。結(jié)果表明，早期氯化鎘暴露能夠損害幼魚的自發(fā)運動能力。

圖2 36 hpf～6 dpf氯化鎘暴露對6 dpf幼魚自發(fā)運動的影響

圖3 乙醇急性暴露對6 dpf幼魚自發(fā)運動的影響

2．2 鎘暴露后幼魚驚恐反射及適應(yīng)能力改變

本研究選擇的實驗時間為斑馬魚白天活動平臺期，在轉(zhuǎn)移至黑暗環(huán)境中適應(yīng)一段時間后，斑馬魚幼魚表現(xiàn)為靜息或平穩(wěn)游動。突然給予強光照射，正常幼魚對外界刺激的反應(yīng)表現(xiàn)為驚跳后迅速靜止不動或速度明顯降低。而突然撤除光源后，幼魚表現(xiàn)為速度激增后又逐漸減慢的過程。以光、暗交替時刻前后1 min內(nèi)速度變化以及光、暗期內(nèi)每分鐘移動距離作為行為學(xué)指標(biāo)評價幼魚對外界刺激的反應(yīng)和適應(yīng)能力。如圖4所示。其中，0．1～0．5 μmol·L-1組幼魚暗-光交替時加速度增大運動狀態(tài)以興奮為主;而光-暗交替時，暴露組幼魚運動加速度呈劑量依賴性降低。此外，正常對照組幼魚在轉(zhuǎn)入黑暗環(huán)境后5 min即可恢復(fù)到光照前運動水平。與正常對照組光照前的平均水平相比，0．1 和0．25 μmol·L-1暴露組在撤除光源后5 min運動仍很活躍;0．5 μmol·L-1暴露組暗恢復(fù)時程則縮短為4 min;1．0 μmol·L-1暴露組除在第3分鐘時運動水平有所下降外，其余時間均未表現(xiàn)出顯著變化。與同時間內(nèi)正常對照組運動水平相比，在撤除光源4 min內(nèi)暴露組幼魚恢復(fù)能力呈劑量依賴性倒“U”型改變。

圖4 36 hpf～6 dpf氯化鎘暴露對6 dpf幼魚驚恐反射實驗中反應(yīng)能力和適應(yīng)能力的影響

以上結(jié)果表明，0．1 ～0．5 μmol·L-1組幼魚對外界刺激反應(yīng)比較敏感，0．1 和 0．25 μmol·L-1組刺激后恢復(fù)能力減弱。而1．0μmol·L-1組反應(yīng)比較遲鈍，運動能力一直在低水平徘徊。

3 討論(Discussion)

鎘作為一種重要的環(huán)境重金屬污染物污染，可以在生物體內(nèi)富集，并通過食物鏈進(jìn)入人體，引起慢性鎘中毒。因此鎘對人體健康，特別是對未成年人發(fā)育的毒性影響日益引起關(guān)注。模式動物斑馬魚除具有容易飼養(yǎng)、實驗操作方便等特點外，胚胎和早期幼魚在神經(jīng)發(fā)育毒性研究中又有獨特優(yōu)勢［10，17］。首先，斑馬魚發(fā)育早期通體透明，容易應(yīng)用染色劑、熒光抗體、基因探針等技術(shù)整體觀察神經(jīng)組織或器官的器質(zhì)性病變。第二，幼魚運動行為按照固定的順序發(fā)育，發(fā)育過程中能夠產(chǎn)生運動、探索、學(xué)習(xí)等一系列復(fù)雜行為的變化。而行為活動作為最敏感的指標(biāo)［18］，是機體通過自身機能的調(diào)整消除或減少損傷的表觀反映。行為學(xué)的檢測雖然相對比較簡單，但能夠從宏觀上早期發(fā)現(xiàn)外源化合物引起的神經(jīng)功能性障礙，較引起器質(zhì)性改變后的病理學(xué)檢查更為直接、敏感并且經(jīng)濟(jì)、有效。本次實驗中造成神經(jīng)行為學(xué)改變的最高暴露劑量為1．0μmol·L-1，比斑馬魚的半數(shù)致死濃度(168 μmol·L-1)［19］、嗅覺依賴性對捕食者回避行為損傷的劑量(125μmol·L-1)［20］或引起胚胎腦部發(fā)育不良的暴露劑量(100 μmol·L-1)［11］要小100多倍。而最早染毒時期為36 hpf，此時胚胎體軸、肌節(jié)和心臟、腦等已基本形成［16］。因此，實驗中暴露組幼魚的神經(jīng)行為表現(xiàn)能夠充分反映整體神經(jīng)功能變化，較于病理損傷或死亡更為直觀、敏感。

本實驗檢測了早期持續(xù)性鎘暴露所致斑馬魚幼魚自發(fā)運動能力變化，結(jié)果表明，鎘暴露組幼魚的行為強度變化與環(huán)境污染物之間存在倒“U”型劑量-效應(yīng)關(guān)系。這與乙醇急性暴露時斑馬魚幼魚產(chǎn)生的行為方式相類似。有研究認(rèn)為，乙醇暴露能夠損傷斑馬魚的視神經(jīng)［17，21］，降低視覺敏感性，損傷中樞神經(jīng)元、運動神經(jīng)元和抑制骨骼的發(fā)育［22-23］，亦或影響腦內(nèi)多巴胺受體的敏感性［24］，從而改變斑馬魚的運動能力。而鎘在生物體內(nèi)具有明顯的蓄積作用，本實驗中暴露組幼魚的興奮行為是否源于鎘暴露導(dǎo)致的神經(jīng)痛;運動抑制行為產(chǎn)生的原因是否是為鎘中毒所致的中樞神經(jīng)和運動神經(jīng)功能障礙或相關(guān)組織如眼、骨骼肌發(fā)育不良等，尚需進(jìn)一步研究。

光照驚恐反射是一種由視覺誘導(dǎo)的明顯生理反應(yīng)。正常斑馬魚在經(jīng)過一段時間的適應(yīng)后，如其所在區(qū)域的光線突然變暗或者變亮，它會有一個迅速逃脫該區(qū)域的動作。斑馬魚的驚恐反應(yīng)于68 hpf產(chǎn)生，斑馬魚的眼睛正在形成且視網(wǎng)膜神經(jīng)元突觸也正在建立，而發(fā)育至96 hpf后，幼年斑馬魚具有自由運動的能力［25］。因此，光照刺激引發(fā)的驚恐反應(yīng)能力和刺激撤除后行為恢復(fù)能力的變化，可用于檢測由視覺引發(fā)的感覺運動高級神經(jīng)回路是否正常。本實驗中鎘暴露后斑馬魚幼魚在驚恐反射中表現(xiàn)出對突發(fā)外界刺激的反應(yīng)能力以及撤除刺激后的適應(yīng)能力呈現(xiàn)劑量依賴性增強或減弱的變化。一方面印證了自發(fā)運動中行為毒性效應(yīng)在光刺激出現(xiàn)時引起運動興奮或抑制效應(yīng)，并因此導(dǎo)致相應(yīng)的暗適應(yīng)時程的延緩或加速。另一方面，驚恐反應(yīng)敏感提示暴露劑量下幼魚的視覺功能未受到影響，但運動功能受到損傷;而1．0μmol·L-1組幼魚反應(yīng)遲鈍則表明，在該劑量下幼魚除運動功能受損外還可能存在視覺功能障礙。另外，本實驗中正常幼魚在驚恐反射光照期內(nèi)表現(xiàn)出短暫逃避行為后的運動抑制現(xiàn)象與筆者之前于夜間所做的驚恐反射實驗中運動激增的表現(xiàn)不一致［26］，表明斑馬魚在白天和夜晚對視覺引導(dǎo)的驚恐反應(yīng)方式存在差異。

本實驗應(yīng)用幼魚運動行為儀和相關(guān)軟件的基礎(chǔ)上采用的視頻采集、圖像跟蹤技術(shù)進(jìn)行高通量的檢測，能夠同時觀察對多個劑量組、多實驗對象運動軌跡的實時變化、并對多個運動參數(shù)進(jìn)行定量分析，減少了哺乳動物實驗中存在的實驗時間耗時長、實驗動物存在應(yīng)激等弊端，提高檢測效率和實驗結(jié)果的客觀、真實性。并且，實驗中對乙醇急性暴露后斑馬魚幼魚的倒“U”型行為毒性效應(yīng)不僅驗證了前人的［14，24］研究結(jié)果，還證明了斑馬魚幼魚運動行為學(xué)的高通量檢測技術(shù)具有良好的可重復(fù)性。此項技術(shù)的應(yīng)用能夠拓展模式動物斑馬魚作為替代模型在毒理學(xué)研究中的應(yīng)用空間，同時為建立環(huán)境污染監(jiān)測預(yù)警技術(shù)提供理論依據(jù)。

［1］ Saygi S，Denis C，Kutsal O，et al．Chronic effects of cadmium on kidiney，liver，testis and fertility of male rats［J］．Biological Trace Element Research，1991，31(3):209-214

［2］ 梁友信．勞動衛(wèi)生與職業(yè)病學(xué)［M］．4版．北京:人民衛(wèi)生出版社，2000:167-681

［3］ Weiss B，Spyker JM．The susceptibility of the fetus and child to chemical pollutants:Behavioral implications of prenatal and early postnatal exposure to chemical pollutants［J］．Pediatrics，1974，53(5):851-859

［4］ Chisolm Jr J J．Heavy metal exposures:Toxicity from metal-metal interactions，and behavioral effects ［J］．Pediatrics，1974，53(5):841-843

［5］ Thatcher RW，Lester M L，McAlaster R，etal．Effects of low levels of cadmium and lead on cognitive functioning in children ［J］．Archives of Environmental Health，1982，37(3):159-166

［6］ Dési I，Nagymajtényi L，Schulz H．Behavioural and neurotoxicological changes caused by cadmium treatment of rats during development［J］．Journalof Applied Toxicology，1998，18(1):63-70

［7］ 朱俊德，余資江，戈果，等．慢性鎘中毒對小鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬CA3區(qū)的影響［J］．環(huán)境與健康雜志，2009，26(7):576-579 Zhu JD，Yu Z J，Ge G，et al．Effects of chronic cadmium exposure on learning，memory and hippocampus CA3 in mice［J］．Journal of Environment and Health，2009，26(7):576-579(in Chinese)

［8］ Baranski B．Effect of prenatal exposure to cadmium on avoidance acquisition in rats ［J］．Medycyna Pracy，1983，34(5-6):381-383

［9］ Ali M M，Murthy R C，Chandra S V．Developmental and long term neurobehavioral toxicity of low level inutero cadmium exposure in rats［J］．Neurobehavior Toxicoloy and Teratology，1986，8(5):463-468

［10］ Linney E，Upchurch L，Donerly S．Zebrafish as a neurotoxicologicalmodel［J］．Neurotoxicology and Teratology，2004，26(6):709-718

［11］ Chow E S，HuiM N，Lin CC，etal．Cadmium inhibits neurogenesis in zebrafish embryonic brain development［J］．Aquatic Toxicology，2008，87(3):157-169

［12］ 鄒蘇琪，殷梧，楊昱鵬，等．斑馬魚行為學(xué)實驗在神經(jīng)科學(xué)中的應(yīng)用［J］．生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2009，36(1):5-12 Zou SQ，YinW，Yang Y P，etal．The ethology application of zebrafish in neuroscience［J］．Progress in Biochemistry and Biophysics，2009，36(1):5-12(in Chinese)

［13］ Tierney K B．Behavioural assessments of neurotoxic effects and neurodegeneration in zebrafish ［J］．Biochimica et Biophysica Acta，2011，1812(3):381-389

［14］ MacPhail RC，Brooks J，Hunter D L，etal．Locomotion in larval zebrafish:Influence of time of day，lighting and ethanol［J］．Neurotoxicology，2009，30(1):52-58

［15］ Westerfield M．The Zebrafish Book(4th)［M］．Eugene:University of Oregon Press，2000:28-196

［16］ Kimmel C，Ballard W W，Kimmel SR，et al．Stages of embryonic development in the zebrafish［J］．Developmental Dynamics，1995，203(3):253-310

［17］ Parng C，Roy N M，Ton C，etal．Neurotoxicity assessment using zebrafish［J］．Journal of Pharmacological and Toxicological Methods，2007，5(1):103-112

［18］ Agency for Toxic Substances and Disease Registry(ATSDR)．Toxicological Profile for Cadmium ［R］．Atlanta:U．S．Department of Health and Human Services，1999

［19］ Cheng SH，Wai A W K，So C H，et al．Cellular and molecular basis of cadmium-induced deformities in zebrafish embryos［J］．Environmental Toxicology and Chemistry，2000，19(12):3024-3031

［20］ Blechinger SR，Kusch R C，Haugo K，et al．Brief embryonic cadmium exposure induces a stress response and cell death in the developing olfactory system followed by long-term olfactory deficits in juvenile zebrafish ［J］．Toxicology and Applied Pharmacology，2007，224(1):72-80

［21］ Matsui JL，Egana A L，Sponboltz TR，etal．Effects of ethanol on photoreceptors and visual function in developing zebrafish［J］．Investigative Opthalmology＆ Visual Science，2006，47(10):4589-4597

［22］ Carvan IIIM J，Loucks E，Weber D N，et al．Ethanol effects on the developing zebrafish:Neurobehavior and skeletalmorphogenesis［J］．Neurotoxicology and Teratology，2004，26(6):757-768

［23］ Sylvain N J，Brewster D L，AliDW．Zebrafish embryos exposed to alcohol undergo abnormal development of motor［J］．Neurotoxicology and Teratology，2010，32(1):472-480

［24］ Irons T D，MacPhail R C，Hunter D L，et al．Acute neuroactive drug exposures alter locomotor activity in larval zebrafish ［J］．Neurotoxicology and Teratology，2010，32(1):84-90

［25］ Easter SS，Nicola G N．The development of vision in the zebrafish(Danio rerio)［J］．Developmental Biology，1996，180(2):646-663

［26］ 史慧勤，張利軍，彭輝，等．氯丙嗪在斑馬魚胚胎和早期幼魚發(fā)育過程中的神經(jīng)毒性作用［J］．中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2011，21(10-11):150-156 Shi H Q，Zhang L J，Peng H，et al．Developmental neurotoxicity effect of chlorpromazine on zebrafish embryo and larvae［J］．Chinese Journal of Comparative Medicine，2011，21(10-11):150-156(in Chinese)◆