氯化鎘暴露對斑馬魚幼魚神經行為毒性作用

史慧勤，張利軍，苑曉燕，彭輝，趙君，彭雙清

軍事醫學科學院疾病預防控制所毒理學評價研究中心，北京100071

鎘是一種重要的環境重金屬污染物，由吸入含鎘的煙霧和灰塵引起急性鎘中毒歷來是危害公共衛生安全的重要事件，而對食品安全問題的擔憂使得人們更加重視水源、可食水生生物以及農作物中鎘污染的問題。鎘具有蓄積性，可造成肝、腎、骨骼等全身多臟器的損傷［1-2］，并且可透過胎盤影響胎兒，因而對出生前后低劑量鎘暴露引起的發育障礙尤其是對胎兒和嬰幼兒神經發育方面影響也廣受關注。臨床研究認為，胎兒期慢性鎘暴露能夠抑制神經系統發育并引起嬰幼兒認知功能障礙以及感覺運動能力減弱、多動癥和注意力障礙等［3-5］。兒童期體內鎘負荷量增高可造成精神運動性發育障礙，損害感知覺能力、語言能力并造成智力下降［3-4］。嚙齒動物實驗結果表明，出生前后低水平的鎘暴露會影響小鼠電生理學功能和高級神經系統功能［6］。另外，低劑量長期染毒會減少海馬CA3區神經元和反應性增多星型神經膠質細胞，導致小鼠學習、記憶能力降低［7］。小鼠胎仔宮內鎘暴露后，出現劑量依賴性的獲得性條件回避反射能力損害及異常行為表現，并在發育至成年后具有遠期行為損害效應［8-9］。

斑馬魚具有典型的脊椎動物腦部形態特征，并且分子遺傳學和發育生物學背景明確，已被廣泛應用于毒理學神經發育研究［10］。Chow 等［11］研究發現，發育早期鎘暴露能夠抑制斑馬魚胚胎的神經元和神經膠質細胞分化，導致胚胎頭部發育不良，神經前體基因表達降低，進而證實鎘通過損害斑馬魚神經細胞生成，導致神經分化顯著降低和軸突形成減少來發揮神經發育毒性作用。斑馬魚的神經組織和器官結構雖然簡單但能夠支配復雜行為活動，如逃避、捕食、群體交互及學習、記憶等［12-13］。本實驗檢測了發育早期階段經過低劑量鎘長時間暴露的斑馬魚幼魚的運動行為特征，目的是為探索應用高通量的神經行為學方法檢測水環境中鎘污染和提高斑馬魚幼魚作為神經發育毒理學模型的應用效能提供實驗依據。

1 材料與方法(M aterials and methods)

1．1 主要試劑及配制

氯化鎘(cadmium chloride)(99．0%)，北京化工廠。幼魚孵化液(30%Danieau＇s 液):17．4 mmol·L-1NaCl、0．21 mmol·L-1KCl、0．12 mmol·L-1MgSO4、0．15 mmol·L-1Ca(NO3)2、1．5mmol·L-1Hepes(pH 7．2)。參照文獻［11，14］，用幼魚孵化液配制0．5 ～2．0 μmol·L-1的氯化鎘受試液和0．5% ～4%乙醇溶液。亞甲基藍，溫州市化學試劑有限公司，先用滅菌水配制0．1%母液，使用時稀釋500倍。

1．2 動物飼養和魚卵采集

斑馬魚親魚為AB系，由北京大學生命科學研究院惠贈。斑馬魚的養殖和繁殖參照Westerfield的方法［15］。光照周期 L∶D=14 h∶10 h，水溫(28±1)℃，養魚系統循環水為去離子水加海鹽，保持電導率450～500 μs·cm-1，用 NaHCO3調節 pH 值為7．0左右。使用新鮮孵化的豐年蝦喂養，一日2次。5月齡后雌雄魚分箱飼養。

實驗前1天晚間將7～18月齡成魚放入交配缸(雌∶雄=1∶1)。次日清晨取隔板后，采集30 min內產受精卵，用循環水清洗2遍后放入孵化液中，同時加入亞甲基藍溶液防止真菌產生，于28．5℃繼續孵化。受精后2 h(2 hpf)體式顯微鏡下觀察，確定發育階段［16］并選擇正常受精卵備用。

1．3 實驗儀器

Noldus幼魚運動行為儀(Noldus Information Technology，美國);體式顯微鏡及成像系統(OLYMPUS SZX16，日本);電子天平(Sartorius BT224S和LP1200S，德國)。

1．4 行為學實驗準備和受試液處理

將收集36 hpf斑馬魚胚胎置于6孔板中，約60枚/孔。吸凈孵化水后迅速加入5 mL氯化鎘受試溶液，每孔一個劑量濃度。給藥后放入28．5℃孵箱中繼續孵化。及時取出死亡魚卵或幼魚。至6 dpf前每日更換2次受試液，每次更換2．5mL。實驗同時設正常對照組，每日更換新鮮孵化水。6 dpf時在體式顯微鏡下觀察記錄幼魚的形態變化，記錄死亡和畸形情況以及畸形特征。選擇96 hpf死亡率和畸形率＜5%的劑量組幼魚作為實驗用魚。將外觀正常的幼魚逐條放入潔凈48孔板中，24條/劑量組。每孔保持1 mL受試液。乙醇處理方法:將5 mL不同濃度乙醇溶液分別放入潔凈6孔板中，1劑量組/孔。用小濾勺將正常對照6 dpf幼魚迅速移至6孔板中，60條/劑量組。然后逐條轉移幼魚至48孔板中，24條/劑量組。每孔1 mL受試液。同時設立正常對照。

1．5 幼魚自發運動觀察

將48孔板放入Noldus幼魚運動行為儀內適應5 min。采集3 min幼魚自發運動視頻。應用Ethovision XT軟件(Noldus Information Technology)將運動軌跡可視化，導出3 min內幼魚移動距離、運動速度等運動參數。乙醇暴露組的實驗時間為:4%組為暴露后30 min;1%、2%組為暴露后45 min;0．5%組為暴露后1 h。實驗同時設正常對照。實驗時段為12:30—15:30，接近幼魚運動平臺期［14］。

1．6 幼魚對強光刺激的驚恐逃避反射實驗

將48孔板放入Noldus幼魚運動行為儀內適應5 min后，控制Noldus幼魚運動行為儀采集11 min幼魚運動視頻，其中前5 min為黑暗期，第6 min通過Ethovision XT軟件編程控制行為儀開啟底燈強光照射1 min后迅速關閉。應用Ethovision XT軟件導出每分鐘幼魚運動速度、移動距離等參數。實驗同時設正常對照。實驗時段為12:30—15:30。

1．7 結果統計和分析

將運動參數按劑量組整理匯總，用平均數±標準誤差(Mean±SD)表示。應用軟件SPSS11．5進行單因素One-Way方差分析，即在方差齊性檢驗的基礎上分別采用LSD(方差齊時)或Tamhane(方差不齊時)檢驗，比較正常對照組和各劑量組間運動參數差異，當P＜0．05時，認為差異具有統計學意義。

2 結果(Results)

在36 hpf～6 dpf期限內鎘暴露組幼魚死亡率畸形率均低于5%。體式顯微鏡下觀察可見，暴露劑量≤1．0 μmol·L-1時，除個別幼魚體色變淺外，外觀形態未見明顯異常，可用于行為學實驗。

2．1 低劑量氯化鎘暴露對斑馬魚幼魚自發運動的影響

將6 dpf幼魚的自發運動軌跡可視化，結果顯示:與正常對照相比，0．1 ～0．5 μmol·L-1暴露組幼魚運動自發運動軌跡增多、紊亂，并伴有刻板式轉向活動增多，觸壁反射活動減少;而0．5 ～1．0 μmol·L-1暴露組幼魚出現僵直、震顫和小范圍內轉圈現象，以1．0μmol·L-1組更為明顯(見圖1)。以上結果表明，胚胎期和幼魚早期階段持續性氯化鎘暴露能夠改變幼魚的運動方式。

圖1 36 hpf～6 dp f氯化鎘暴露后6 dpf幼魚運動軌跡

自發運動參數分析發現，在0．1 ～1．0 μmol·L-1范圍內隨暴露劑量增大，幼魚自發運動距離由增高轉向降低，呈現明顯的劑量依賴性倒“U”型反應趨勢(圖2A)，而由于 0．25 ～1．0 μmol·L-1暴露組幼魚增快和減慢2種運動并存，因而平均速度值沒有顯著性差異(圖2B)，通過最大移動速度、快速運動(速度≥2．0 cm·s-1)持續時間及出現頻率比較(圖2C、2D、2E)，發現雖然組內參數差異較大，但各劑量組依然從一定程度上能夠反映組間倒“U”型毒性效應，這與實驗中乙醇暴露后幼魚產生的倒“U”型運動效應相類似，即0．5% ～2%乙醇較長時程暴露具有運動興奮效應，而4%乙醇較短時程暴露則具有明顯的抑制作用(見圖3)。結果表明，早期氯化鎘暴露能夠損害幼魚的自發運動能力。

圖2 36 hpf～6 dpf氯化鎘暴露對6 dpf幼魚自發運動的影響

圖3 乙醇急性暴露對6 dpf幼魚自發運動的影響

2．2 鎘暴露后幼魚驚恐反射及適應能力改變

本研究選擇的實驗時間為斑馬魚白天活動平臺期，在轉移至黑暗環境中適應一段時間后，斑馬魚幼魚表現為靜息或平穩游動。突然給予強光照射，正常幼魚對外界刺激的反應表現為驚跳后迅速靜止不動或速度明顯降低。而突然撤除光源后，幼魚表現為速度激增后又逐漸減慢的過程。以光、暗交替時刻前后1 min內速度變化以及光、暗期內每分鐘移動距離作為行為學指標評價幼魚對外界刺激的反應和適應能力。如圖4所示。其中，0．1～0．5 μmol·L-1組幼魚暗-光交替時加速度增大運動狀態以興奮為主;而光-暗交替時，暴露組幼魚運動加速度呈劑量依賴性降低。此外，正常對照組幼魚在轉入黑暗環境后5 min即可恢復到光照前運動水平。與正常對照組光照前的平均水平相比，0．1 和0．25 μmol·L-1暴露組在撤除光源后5 min運動仍很活躍;0．5 μmol·L-1暴露組暗恢復時程則縮短為4 min;1．0 μmol·L-1暴露組除在第3分鐘時運動水平有所下降外，其余時間均未表現出顯著變化。與同時間內正常對照組運動水平相比，在撤除光源4 min內暴露組幼魚恢復能力呈劑量依賴性倒“U”型改變。

圖4 36 hpf～6 dpf氯化鎘暴露對6 dpf幼魚驚恐反射實驗中反應能力和適應能力的影響

以上結果表明，0．1 ～0．5 μmol·L-1組幼魚對外界刺激反應比較敏感，0．1 和 0．25 μmol·L-1組刺激后恢復能力減弱。而1．0μmol·L-1組反應比較遲鈍，運動能力一直在低水平徘徊。

3 討論(Discussion)

鎘作為一種重要的環境重金屬污染物污染，可以在生物體內富集，并通過食物鏈進入人體，引起慢性鎘中毒。因此鎘對人體健康，特別是對未成年人發育的毒性影響日益引起關注。模式動物斑馬魚除具有容易飼養、實驗操作方便等特點外，胚胎和早期幼魚在神經發育毒性研究中又有獨特優勢［10，17］。首先，斑馬魚發育早期通體透明，容易應用染色劑、熒光抗體、基因探針等技術整體觀察神經組織或器官的器質性病變。第二，幼魚運動行為按照固定的順序發育，發育過程中能夠產生運動、探索、學習等一系列復雜行為的變化。而行為活動作為最敏感的指標［18］，是機體通過自身機能的調整消除或減少損傷的表觀反映。行為學的檢測雖然相對比較簡單，但能夠從宏觀上早期發現外源化合物引起的神經功能性障礙，較引起器質性改變后的病理學檢查更為直接、敏感并且經濟、有效。本次實驗中造成神經行為學改變的最高暴露劑量為1．0μmol·L-1，比斑馬魚的半數致死濃度(168 μmol·L-1)［19］、嗅覺依賴性對捕食者回避行為損傷的劑量(125μmol·L-1)［20］或引起胚胎腦部發育不良的暴露劑量(100 μmol·L-1)［11］要小100多倍。而最早染毒時期為36 hpf，此時胚胎體軸、肌節和心臟、腦等已基本形成［16］。因此，實驗中暴露組幼魚的神經行為表現能夠充分反映整體神經功能變化，較于病理損傷或死亡更為直觀、敏感。

本實驗檢測了早期持續性鎘暴露所致斑馬魚幼魚自發運動能力變化，結果表明，鎘暴露組幼魚的行為強度變化與環境污染物之間存在倒“U”型劑量-效應關系。這與乙醇急性暴露時斑馬魚幼魚產生的行為方式相類似。有研究認為，乙醇暴露能夠損傷斑馬魚的視神經［17，21］，降低視覺敏感性，損傷中樞神經元、運動神經元和抑制骨骼的發育［22-23］，亦或影響腦內多巴胺受體的敏感性［24］，從而改變斑馬魚的運動能力。而鎘在生物體內具有明顯的蓄積作用，本實驗中暴露組幼魚的興奮行為是否源于鎘暴露導致的神經痛;運動抑制行為產生的原因是否是為鎘中毒所致的中樞神經和運動神經功能障礙或相關組織如眼、骨骼肌發育不良等，尚需進一步研究。

光照驚恐反射是一種由視覺誘導的明顯生理反應。正常斑馬魚在經過一段時間的適應后，如其所在區域的光線突然變暗或者變亮，它會有一個迅速逃脫該區域的動作。斑馬魚的驚恐反應于68 hpf產生，斑馬魚的眼睛正在形成且視網膜神經元突觸也正在建立，而發育至96 hpf后，幼年斑馬魚具有自由運動的能力［25］。因此，光照刺激引發的驚恐反應能力和刺激撤除后行為恢復能力的變化，可用于檢測由視覺引發的感覺運動高級神經回路是否正常。本實驗中鎘暴露后斑馬魚幼魚在驚恐反射中表現出對突發外界刺激的反應能力以及撤除刺激后的適應能力呈現劑量依賴性增強或減弱的變化。一方面印證了自發運動中行為毒性效應在光刺激出現時引起運動興奮或抑制效應，并因此導致相應的暗適應時程的延緩或加速。另一方面，驚恐反應敏感提示暴露劑量下幼魚的視覺功能未受到影響，但運動功能受到損傷;而1．0μmol·L-1組幼魚反應遲鈍則表明，在該劑量下幼魚除運動功能受損外還可能存在視覺功能障礙。另外，本實驗中正常幼魚在驚恐反射光照期內表現出短暫逃避行為后的運動抑制現象與筆者之前于夜間所做的驚恐反射實驗中運動激增的表現不一致［26］，表明斑馬魚在白天和夜晚對視覺引導的驚恐反應方式存在差異。

本實驗應用幼魚運動行為儀和相關軟件的基礎上采用的視頻采集、圖像跟蹤技術進行高通量的檢測，能夠同時觀察對多個劑量組、多實驗對象運動軌跡的實時變化、并對多個運動參數進行定量分析，減少了哺乳動物實驗中存在的實驗時間耗時長、實驗動物存在應激等弊端，提高檢測效率和實驗結果的客觀、真實性。并且，實驗中對乙醇急性暴露后斑馬魚幼魚的倒“U”型行為毒性效應不僅驗證了前人的［14，24］研究結果，還證明了斑馬魚幼魚運動行為學的高通量檢測技術具有良好的可重復性。此項技術的應用能夠拓展模式動物斑馬魚作為替代模型在毒理學研究中的應用空間，同時為建立環境污染監測預警技術提供理論依據。

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