丁苯酞對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷神經(jīng)保護(hù)作用的研究

臧福才 唐偉 白鷹

細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死不同，細(xì)胞凋亡不是一件被動(dòng)的過(guò)程，而是主動(dòng)過(guò)程，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等的作用，它并不是病理?xiàng)l件下，自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動(dòng)爭(zhēng)取的一種死亡過(guò)程。本文研究丁苯酞對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷神經(jīng)保護(hù)作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 4-0尼龍單線。紅四氮唑，上海圣宇化工有限公司。TUNEL試劑盒，武漢博士德公司。DAB顯色試劑盒，武漢博士德公司。丁苯酞膠囊，石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠30只，體重280～300 g，由大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物室提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型制備 依據(jù)Nagasawa方法[1]，用10%水合氯醛（35mg/kg）行腹腔麻醉，常規(guī)備皮，頸部消毒，沿頸正中線切開(kāi)皮膚，分離皮下及肌肉組織，充分暴露并分離右頸總動(dòng)脈，結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，同時(shí)分離頸內(nèi)動(dòng)脈，于頸總動(dòng)脈分叉部橫切一小口，將頭端加熱成光滑圓球的4-0尼龍單線自切口處插入，進(jìn)入大腦前動(dòng)脈近端，停止推送。此時(shí)，在右側(cè)大腦中動(dòng)脈起始部阻斷了來(lái)自頸內(nèi)動(dòng)脈、大腦前動(dòng)脈和大腦后動(dòng)脈的所有血流。扎緊備線，留1.5 cm長(zhǎng)線頭于體表，縫合創(chuàng)口。再灌注于缺血2小時(shí)后進(jìn)行，輕拉尼龍線，其球端退回頸總動(dòng)脈分叉處。

1.3.2 給藥方法 將丁苯酞溶解于食用油中，濃度5 mg/ml，于形成缺血再灌注后1 h時(shí)按1 ml/100 g劑量灌胃給藥。對(duì)照組給予單純的食用油，按1 ml/100 g灌胃，給藥時(shí)間同丁苯酞組。

1.3.3 分組 將30只大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組（15只） 和丁苯酞組（15只） 。

1.4 細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 將大鼠斷頭，取腦，于4%多聚甲醛液中固定24 h，石蠟包埋，行連續(xù)冠狀切片（片厚4 mm）；將組織切片置于染色缸中，用二甲苯洗2次，每次5 min，用無(wú)水乙醇洗兩次，每次3 min，用95%和75%乙醇各洗1次，每次3 min，PBS洗5 min 加入蛋白酶K溶液（20μg/ml），于室溫水解15 min，去除組織蛋白，蒸餾水洗4次，2min/次，色缸中加入含2%過(guò)氧化氫的PBS，于室溫反應(yīng)5 min，BS洗2次，每次5 min；濾紙小心吸去載玻片上組織周?chē)亩嘤嘁后w，立即在切片上加2滴 TdT酶緩沖液，置室溫1～5 min，用濾紙小心吸去切片周?chē)亩嘤嘁后w，立即在切片上滴加54 μl TdT酶反應(yīng)液，置濕盒中于37 ℃反應(yīng) 1 hr（注意：陰性染色對(duì)照，加不含TdT酶的反應(yīng)液）；切片置于染色缸中，加入已預(yù)熱到37 ℃的洗滌與終止反應(yīng)緩沖液，于37 ℃保溫30 min，每10 min將載玻片輕輕提起和放下一次，使液體輕微攪動(dòng)；組織切片用PBS洗 3次，每次 5 min后，直接在切片上滴加兩滴過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體，于濕盒中室溫反應(yīng)30 min；PBS洗4次，每次5 min；組織切片上直接滴加新鮮配制的0.05%DAB溶液，室溫顯色3～6 min；蒸餾水洗4次，前3次每次1 min，最后1次5 min；室溫用甲基綠進(jìn)行復(fù)染10 min。用蒸餾水洗3次，前兩次將載玻片提起放下10次，最后1次靜置30 s。依同樣方法再用100%正丁醇洗3次；二甲苯脫水3次，每次2 min，封片、干燥后，在光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。判斷：光學(xué)顯微鏡下觀察，細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性（凋亡細(xì)胞） 。在大腦皮層梗死周?chē)鷧^(qū)，隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野（×400），計(jì)數(shù)每個(gè)視野的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)使用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

丁苯酞組凋亡細(xì)胞數(shù)（20.35±4.16）個(gè)，對(duì)照組凋亡細(xì)胞數(shù)（34.90±6.10）個(gè)，丁苯酞組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯低于對(duì)照組（P<0.05）。丁苯酞組（圖2）的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)明顯低于對(duì)照組（圖1）。

圖1 對(duì)照組 TUNEL法（中倍放大）

圖2 丁苯酞組 TUNEL法（中倍放大）

3 討論

Kirino在腦缺血模型中首次觀察到海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞遲發(fā)死亡現(xiàn)象[2]，Du又在局灶性腦缺血模型中觀察到腦梗死形成遲發(fā)現(xiàn)象[3]，此后大量的研究表明梗死區(qū)內(nèi)遲發(fā)性細(xì)胞死亡是導(dǎo)致腦梗死形成遲發(fā)的主要原因[4]。隨著細(xì)胞凋亡的發(fā)現(xiàn)，人們對(duì)細(xì)胞凋亡形態(tài)、基因調(diào)控、生物化學(xué)等的逐步研究，逐漸證明了此前發(fā)現(xiàn)的遲發(fā)性細(xì)胞死亡實(shí)質(zhì)上就是細(xì)胞凋亡。在本實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用TUNEL法染色，缺血再灌注組的大腦皮層區(qū)可見(jiàn)大量陽(yáng)性細(xì)胞，表明腦缺血再灌注后有細(xì)胞凋亡存在。

細(xì)胞凋亡是緩慢的過(guò)程，時(shí)間會(huì)被延遲幾天至十幾天[5-6]，這給治療提供了治療的時(shí)間窗，因此，拮抗凋亡成為缺血性腦血管病的治療新的靶點(diǎn)，成為當(dāng)下人們研究關(guān)注的焦點(diǎn)。丁苯酞軟膠囊，商品名為恩必普，其化學(xué)名稱(chēng)為消旋-3-正丁基苯酞（簡(jiǎn)稱(chēng)丁苯酞或記NBP）。為石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，是我國(guó)擁有自主知識(shí)產(chǎn)的國(guó)家一類(lèi)新藥。研究表明丁苯酞可通過(guò)提高腦血管內(nèi)皮N0和PGl2的水平。降低細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，抑制谷氨酸釋放．降低花生四烯酸含量，抑制氧自由基和提高抗氧化酶活性等機(jī)制作用于腦缺血所致的多個(gè)病理環(huán)節(jié)[7-11]。本實(shí)驗(yàn)表明丁苯酞組的神經(jīng)元凋亡數(shù)明顯低于對(duì)照組，說(shuō)明了丁苯酞抗凋亡的活性。為丁苯酞在臨床中的應(yīng)用提供了新的有力依據(jù)。

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