36株多重耐藥鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類藥物耐藥基因的流行病學(xué)研究

邢麗丹，糜祖煌，徐鑫鑫，汪 汀，田莎莎，原鴻雁，張 盼，紀曉昀，蘇兆亮，許化溪

2.江蘇省無錫市克隆遺傳技術(shù)研究所。

鮑曼不動桿菌是一類醫(yī)院常見的不發(fā)酵糖革蘭陰性桿菌，屬條件致病菌。在人類，鮑曼不動桿菌可定植于皮膚、傷口、呼吸道和消化道，在免疫力低下時可感染機體發(fā)?。?］。近年來由于抗菌藥物的大量使用和各種侵襲性診療操作的實施，鮑曼不動桿菌的檢出率和耐藥率越來越高，甚至在一些科室呈暴發(fā)流行，引起了臨床和實驗室醫(yī)師的廣泛關(guān)注。鮑曼不動桿菌具有自動上調(diào)或主動獲得耐藥決定因子的能力［2］，其耐藥性正在逐年的增高，而且臨床感染多以多重耐藥菌株為主，對臨床治療帶來了極大的困難和挑戰(zhàn)。對于感染鮑曼不動桿菌患者的治療通常采用β內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類和氟喹諾酮類抗菌藥物，但隨著這些抗菌藥物使用的增加，耐藥菌株越來越多。為了解本地區(qū)鮑曼不動桿菌的流行和耐藥情況，本研究對江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院和鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院于2012年8—11月分離的多重耐藥鮑曼不動桿菌的氨基糖苷類耐藥基因aac（3）－I、aac（6’）－Ib、aph（3’）和16S rRNA甲基化酶基因armA 進行了檢測，旨在為臨床氨基糖苷類抗生素的合理應(yīng)用提供參考?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。

材料與方法

一、材料

臨床分離的36株鮑曼不動桿菌均來自2012年8—11月江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院和鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院36例住院患者的臨床樣本，剔除同一患者同一部位重復(fù)分離的菌株。患者男26例，女10例，年齡9～93歲。樣本分布為：痰液34份，靜脈置管1份，腹水1份。

二、方法

（一）藥物敏感試驗 采用K－B紙片擴散法測定多重耐藥鮑曼不動桿菌對抗菌藥物的敏感性，MH瓊脂和藥敏紙片分別為博賽生物科技有限公司和OXOID公司產(chǎn)品，以大腸埃希菌ATCC 25922和銅綠假單胞菌ATCC27853作為質(zhì)控菌株，并根據(jù)2010年版CLSL標準判斷藥敏試驗結(jié)果。

（二）細菌處理 挑選純培養(yǎng)菌落置入0.5 mL離心管內(nèi)（內(nèi)置50μL裂解液和蛋白酶K的混合物），PCR儀上55℃1 h（消化細菌菌體）后95℃10 min（破壞裂解液內(nèi)的蛋白酶K），然后每管補充200μL純水，即為DNA模板液，置于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

（三）基因檢測 PCR法檢測氨基糖苷類耐藥基因，靶基因引物序列見表1。

PCR擴增體系為：每反應(yīng)體系P1、P2引物各0.5μmol／L，dNTPs各200 mmol／L，KCl 10 mmol／L，（NH4）2SO48 mmol／L，MgCl22 mmol／L，Tris－HCl（pH9.0）10 mmol／L，NP400.5%，BSA0.02%，Taq DNA pol 1 u?？偡磻?yīng)體積20μL（其中模板液5μL）。PCR擴增熱循環(huán)參數(shù)為：93℃預(yù)變性2 min，然后93℃60 s→55℃60 s→72℃60 s，循環(huán)35個周期，最后72℃延長2 min。耐藥基因檢測試劑盒、靶基因PCR引物序列和陽性對照DNA由無錫市克隆遺傳技術(shù)研究所提供。擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外凝膠電泳成像儀下觀察，并記錄結(jié)果。

（四）基因測序 PCR擴增產(chǎn)物在美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司提供的ABI3730型毛細管全自動測序儀上測序，委托上海翰宇生物技術(shù)有限公司完成。

（五）序列比對分析 應(yīng)用Chromas讀序工具軟件，測序結(jié)果用Chromas直接作BLAST（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／BLAST ）比對。

表1 靶基因PCR引物序列及終產(chǎn)物長度Table 1 Target genes and the primers used in PCR assay

結(jié) 果

一、藥物敏感試驗

多重耐藥鮑曼不動桿菌是指對5類抗菌藥物中的3類及以上耐藥，包括氨基糖苷類、β內(nèi)酰胺酶抑制劑、頭孢菌素類、碳青霉烯類和氟喹諾酮類抗菌藥物。36株多重耐藥鮑曼不動桿菌的藥物敏感試驗結(jié)果見表2。

二、氨基糖苷類修飾酶基因檢測

氨基糖苷類乙酰轉(zhuǎn)移酶（acetyltransferase）基因aac （3）－1、aac （6′）－1b、磷酸轉(zhuǎn)移酶（phosphotransferase）基因aph（3′）－1和16S rRNA 甲基化酶（16S rRNA methylase）基因armA 均有不同程度的檢出，aph（3′）－1和armA 陽性率較高。氨基糖苷類修飾酶基因檢測結(jié)果見表3。

表2 36株多重耐藥鮑曼不動桿菌藥敏試驗結(jié)果［n（%）］Table 2 Results of susceptibility testing of the 36 multidrug－resistant strains of Acinetobacter baumannii［n （%）］

表3 36株多重耐藥鮑曼不動桿菌氨基糖苷類耐藥基因結(jié)果［n（%）］Table 3 The prevalence of aminoglycoside－resistant genes in the 36 multidrug－resistant strains of Acinetobacter baumannii［n （%）］

對4種基因的PCR擴增產(chǎn)物進行DNA測序，并進行BLASTn比對分析，結(jié)果與GenBank中已注冊的序列一致，同源性均≥99.0%。

討 論

鮑曼不動桿菌是典型的條件致病菌，在醫(yī)院特別是ICU常呈暴發(fā)流行［3］。鮑曼不動桿菌感染主要發(fā)生在免疫力低下的患者。常見的危險因素有長期住院尤其為長期入住ICU、多器官損害、中心靜脈或動脈置管的使用、導(dǎo)尿管的使用、輔助通氣、血液透析、急癥腹部手術(shù)、腸道定植、胃造口術(shù)或空腸造口術(shù)管的使用和先前使用過任何抗菌藥物等［1］。隨著鮑曼不動桿菌感染患者的增多，抗菌藥物的應(yīng)用進一步導(dǎo)致了多重耐藥甚至泛耐藥鮑曼不動桿菌的出現(xiàn)。細菌對抗菌藥物的耐藥主要是由于耐藥基因表達的各類水解酶。目前用于治療鮑曼不動桿菌的主要抗菌藥物有5類，包括頭孢菌素類（頭孢他啶和頭孢吡肟等），碳青霉烯類（亞胺培南和美羅培南），酶抑制劑復(fù)方（哌拉西林－他唑巴坦），氟喹諾酮類（環(huán)丙沙星和左氧氟沙星）和氨基糖苷類（慶大霉素和阿米卡星）。多重耐藥甚至泛耐藥菌株的出現(xiàn)提示了菌株耐藥機制的多樣性。諸多文獻報道了鮑曼不動桿菌的不同耐藥機制。外排泵基因的表達在多重耐藥鮑曼不動桿菌中發(fā)揮重要的作用［4］。外排泵的5類超家族在鮑曼不動桿菌中最流行的是能夠外排很多抗菌藥物的RND泵的過表達，主要是AdeABC基因的過表達［4］，鮑曼不動桿菌Ade C能泵出的藥物包括β內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、紅霉素、氯霉素、四環(huán)素類、氟喹諾酮類、甲氧芐啶和溴乙啶［5］。插入序列ISAbal的發(fā)現(xiàn)使碳青霉烯類、頭孢菌素類等耐藥基因高表達而導(dǎo)致鮑曼不動桿菌耐藥［3，6］。

氨基糖苷類抗生素對不發(fā)酵糖革蘭陰性桿菌、腸桿菌科及一些革蘭陽性球菌均有很好的抗菌活性，與β內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)用有協(xié)同抗菌作用，在感染治療中占有重要地位。氨基糖苷類抗生素是通過抑制蛋白與16S rRNA合成和破壞細菌細胞膜的完整性的氨基環(huán)多醇殺死細菌［7］，其中主要耐藥機制是產(chǎn)生氨基糖苷類修飾酶［8－9］。氨基糖苷類修飾酶主要包括3類作用機制各不相同的酶：乙酰轉(zhuǎn)移酶修飾依賴于乙酰輔酶A的N－乙酰化，磷酸轉(zhuǎn)移酶修飾依賴于ATP的O－磷酸化，核苷酸轉(zhuǎn)移酶修飾依賴于ATP的腺苷化，降低了它們對核糖體亞單位的親和力［8，10］。氨基糖苷類修飾酶經(jīng)常在流動元素中編碼，如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和整合子，它們大都隱藏在不分類的額外的耐藥決定簇如ESBLs和MBLs中［8，10］。在鮑曼不動桿菌中，所有主要的氨基糖苷類修飾酶都有報道，用I類整合子編碼氨基糖苷類修飾酶的基因的存在在多重耐藥鮑曼不動桿菌中非常流行［11－12］。最近的研究報道了鮑曼不動桿菌中質(zhì)粒介導(dǎo)的16S rRNA甲基化作用，這種機制可以使鮑曼不動桿菌對所有的氨基糖苷類抗生素耐藥［13］。氨基糖苷類抗生素通過作用于細菌核糖體30S亞基的16S rRNA高度保守的A位點，干擾細菌蛋白質(zhì)的合成，從而引起細菌死亡，而質(zhì)粒介導(dǎo)的16S rRNA甲基化酶能夠保護細菌的30S核糖體的16S rRNA不與氨基糖苷類藥物結(jié)合，造成對氨基糖苷類藥物的高水平耐藥。

多重耐藥鮑曼不動桿菌醫(yī)院感染患者常有基礎(chǔ)疾病，或曾接受廣譜抗生素治療。本研究36株多重耐藥鮑曼不動桿菌大部分來自ICU，其次有呼吸內(nèi)科、老年科等。藥敏試驗結(jié)果反映了本組多重耐藥鮑曼不動桿菌的耐藥情況相當(dāng)嚴重，對亞胺培南、頭孢吡肟、頭孢他啶和頭孢曲松的耐藥率均在94.0%以上，對頭孢哌酮－舒巴坦的耐藥率相對較低（16.7%），可能是因為頭孢哌酮和舒巴坦聯(lián)合使用，舒巴坦抑制了β內(nèi)酰胺酶對頭孢哌酮的破壞，增強頭孢哌酮的抗菌活性，而對慶大霉素的高耐藥率與氨基糖苷類耐藥基因有關(guān)［1］。armA為16S rRNA甲基化酶，有報道表明鮑曼不動桿菌的雙圈耐藥現(xiàn)象與armA基因誘導(dǎo)型表達有關(guān)［14］。氨基糖苷類耐藥基因在安徽合肥、浙江寧波、上海、山東泰安、天津、湖南岳陽、江西南昌等很多地區(qū)的鮑曼不動桿菌中廣泛存在［14－20］，與鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類酶的耐藥關(guān)系密切。本研究在一定程度上反映了鎮(zhèn)江地區(qū)鮑曼不動桿菌的耐藥情況比較嚴重，多重耐藥甚至泛耐藥鮑曼不動桿菌的出現(xiàn)提示該菌將是感染治療中的重點和難點。因此，合理使用抗菌藥物是控制耐藥菌醫(yī)院感染的重要手段，也是目前醫(yī)院感染研究的重要課題。

［1］ 李朋玲，蔡培泉，糜祖煌.鮑曼不動桿菌β－內(nèi)酰胺類抗生素耐藥機制研究近展［J］.中華臨床感染病雜志，2012，5（4）：247－252.

［2］ Hu WS，Yao SM，F(xiàn)ung CP，et al.An OXA－66／OXA－51－Like carbapenemase and possibly an effux pump are associated with resistance to imipenem in Acinetobacter baumannii［J］.Antimicrob Agents Chemother，2007，51（11）：3844－3852.

［3］ Corvec S，Poirel L，Naas T，et al.Genetics and expression of the carbapenem－h(huán)ydrolyzing oxacillinase gene blaOXA－23 in Acinetobacter baumannii［J］.Antimicrob Agents Chemother，2007，51（4）：1530－1533.

［4］ Coyne S，Courvalin P，Périchon B.Efflux－mediated antibiotic resistance in Acinetobacter spp［J］.Antimicrob Agents Chemother，2011，55（3）：947－953.

［5］ Ruzin A，Keeney D，Bradford PA.AdeABC multidrug effux pump is associated with decreased susceptibility to tigecycline in Acinetobacter calcoaceticus－Acinetobacter banmannii complex［J］.J Antimicrob Chemother，2007，59（5）：1001－1004.

［6］ Héritier C，Poirel L，Nordmann P.Cephalosporinase overexpression resulting from insertion of ISAba1in Acinetobacter baumannii［J］.Clin Microbiol Infect Dis，2006，12（2）：123－130.

［7］ Shakil S，Khan R，Zarrilli R，et al.Aminoglycosides versus bacteria－a description of the action，resistance mechanism，and nosocomial battleground［J］.J Biomed Sci，2008，15（1）：5－14.

［8］ Poole K.Aminoglycoside resistance in Pseudomonas aeruginosa ［J］.Antimicrob Agents Chemother，2005，49（2）：479－487.

［9］ Mingeot－Leclercq MP，Glupczynski Y，Tulkens PM.Aminoglycosides：activity and resistance［J］.Antimicrob Agents Chemother，1999，43（4）：727－737.

［10］ Strateva T，Yordanov D.Pseudomonas aeruginosa－aphenomenon of bacterial resistance［J］.J Med Microbiol，2009，58（Pt 9）：1133－1148.

［11］ Peleg AY，Seifert H，Paterson DL.Acinetobacter baumannii：emergence of a successful pathogen［J］.Clin Microbiol Rev，2008，21（3）：538－582.

［12］ Nemec A，Dolzani L，Brisse S，et al.Diversity of aminoglycoside－resistance genes and their association with class 1 integrons among strains of pan－European Acinetobacter baumannii cloes［J］.J Med Microbiol，2004，53（Pt 12）：1233－1240.

［13］ Doi Y，Adams JM，Yamane K，et al.Identical of 16S rRNA methylase－producing Acinetobacter baumannii clinical strains in North America［J］.Antimicrob Agents Chemother，2007，51（11）：4209－4210.

［14］ 汪鵬程，蔡俊，閆敏，等.鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類藥物耐藥及其攜帶基因的探討［J］.國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2012，33（10）：1155－1156.

［15］ 陳琳，蔡挺，張順，等.鮑曼不動桿菌氨基糖苷類修飾酶和I類整合酶基因研究［J］.中國抗生素雜志，2008，33（1）：34－40.

［16］ 奚俊，應(yīng)春妹.耐氨基糖苷類抗生素鮑曼不動桿菌中armA和rmtB甲基化酶基因的檢測［J］.中國感染與化療雜志，2010，10（3）：209－212.

［17］ 姜梅杰，馮莉，張福森.多重耐藥鮑曼不動桿菌中氨基糖苷類修飾酶基因及qacEΔl基因的研究［J］.中華臨床醫(yī)師雜志，2012，6（11）：3062－3064.

［18］ 卓啟芳，葛庚芝，畢玲，等.對下呼吸道感染鮑曼不動桿菌氨基糖苷類耐藥基因檢測［J］.天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2012，18（3）：385－391.

［19］ 易敏，姜習(xí)新.鮑曼不動桿菌16S rRNA甲基化酶基因和氨基糖苷類修飾酶基因檢測及作用研究［J］.實用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2012，19（4）：605－607.

［20］ 劉曉慶，陳嬌，李華，等.鮑曼不動桿菌質(zhì)粒上氨基糖苷類耐藥基因的研究［J］.中國抗生素雜志，2012，37（5）：335－356.