2008—2011年北京協(xié)和醫(yī)院流感嗜血桿菌耐藥性監(jiān)測(cè)

牛 翠，張 輝，楊啟文，李 娜

2.邢臺(tái)市第三醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北邢臺(tái) 054000。

流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae）是呼吸道感染的重要病原菌之一，可通過(guò)呼吸道在人與人之間傳播。也可由鼻咽部侵入血流，導(dǎo)致多種感染性疾病如化膿性腦膜炎、小兒肺炎和血流感染、成人社區(qū)獲得性肺炎、中耳炎、慢性支氣管炎急性發(fā)作和急性鼻竇炎等。近年來(lái)由于抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，流感嗜血桿菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率呈上升趨勢(shì)，給臨床抗感染治療帶來(lái)了許多困難。現(xiàn)對(duì)北京協(xié)和醫(yī)院2008—2011年臨床分離的流感嗜血桿菌的耐藥情況作一分析，以指導(dǎo)臨床采取有效的感染控制措施及合理用藥，報(bào)道如下。

材料與方法

一、材料

（一）菌株來(lái)源 收集2008年1月至2011年12月北京協(xié)和醫(yī)院臨床標(biāo)本分離的流感嗜血桿菌，剔除同一患者相同部位的重復(fù)分離菌株后共獲223株。

（二）抗菌藥物紙片 氨芐西林、氨芐西林－舒巴坦、阿莫西林－克拉維酸、頭孢呋辛、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢克洛、氨曲南、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、甲氧芐啶－磺胺甲口惡唑、氯霉素、阿奇霉素、四環(huán)素藥敏紙片和V、X因子、V＋X因子紙片均為英國(guó)OXOID公司產(chǎn)品。測(cè)定β內(nèi)酰胺酶的頭孢硝噻吩紙片為美國(guó)BBL公司產(chǎn)品。

（三）培養(yǎng)基 流感嗜血桿菌選擇性培養(yǎng)基以哥倫比亞瓊脂（OXOID公司產(chǎn)品）為基礎(chǔ)制備巧克力平皿，澆注平皿前（約50℃）加入萬(wàn)古霉素（50 mg／L）。流感嗜血桿菌藥敏培養(yǎng)基（HTM）和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑SR0158E為英國(guó)OXOID公司產(chǎn)品。

（四）VITEK2－NH 試卡 VITEK－2－NH 試卡由法國(guó)生物梅里埃公司提供。

二、方法

（一）菌株分離及鑒定 送檢標(biāo)本立即接種血平皿和加萬(wàn)古霉素巧克力平皿，置于35℃，5%～10%CO2培養(yǎng)24 h。挑取血平皿上不生長(zhǎng)、巧克力平皿上生長(zhǎng)的無(wú)色透明或灰白色半透明、圓形隆起、光滑、邊緣整齊，濕潤(rùn)不溶血、露滴狀菌落、并有特殊閃光，直徑0.5～1 mm的可疑菌落涂片。革蘭染色呈陰性短小桿菌、球桿菌、少數(shù)呈細(xì)絲狀等多形態(tài)性。同時(shí)做衛(wèi)星試驗(yàn)，將可疑菌落同時(shí)接種于血平皿、普通瓊脂（MH）平皿上，密涂劃線，再用金葡菌點(diǎn)種，兩點(diǎn)相距2 mm以上。35℃，5%～10%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。血平皿衛(wèi)星試驗(yàn)陽(yáng)性、MH平皿衛(wèi)星試驗(yàn)陰性者，鑒定為流感嗜血桿菌。同時(shí)進(jìn)行V、X、X＋V因子需求試驗(yàn)，只能在V＋X紙片周?chē)L(zhǎng)者，鑒定為流感嗜血桿菌。疑難菌株用法國(guó)生物梅里埃公司提供的NH卡最終鑒定。

（二）藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法。以HTM瓊脂為培養(yǎng)基，按美國(guó)CLSI標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果。

（三）β內(nèi)酰胺酶測(cè)定 用頭孢硝噻酚顯色反應(yīng)法測(cè)定β內(nèi)酰胺酶。

（四）質(zhì)控菌株 以金葡菌ATCC25923為陰性對(duì)照，流感嗜血桿菌ATCC49247為陽(yáng)性對(duì)照。

（五）統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用WHONET5.6對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、流感嗜血桿菌的分布

（一）年齡分布 2008年1月1日至2011年12月31日共收集到223株流感嗜血桿菌，其中分離自成人（≥18歲）的菌株為208株，占93.3%；分離自未成年人（＜18歲）的菌株為15株，占6.7% 。

（二）科室分布 223株流感嗜血桿菌分離自門(mén)診101株（45.3%）；分離自住院患者122株（54.7%），其中呼吸內(nèi)科17株（7.6%），其他內(nèi)科共90株（40.4%），外科10株（4.5%），兒科5株（2.2%）。

（三）標(biāo)本分布 223株流感嗜血桿菌分離自痰液194株（87.0%），咽拭子、支氣管肺泡灌洗液等呼吸道標(biāo)本28株（12.6%），血培養(yǎng)1株（0.4%）。

二、223株流感嗜血桿菌對(duì)各種抗菌藥物的耐藥性

本次檢測(cè)的流感嗜血桿對(duì)單環(huán)β內(nèi)酰胺類（氨曲南），喹諾酮類（環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星），加酶抑制劑（阿莫西林－克拉維酸、氨芐西林－舒巴坦），大環(huán)內(nèi)酯類（阿奇霉素）抗菌藥物的敏感率都在90.0%以上；對(duì)第二代頭孢菌素（頭孢呋辛、頭孢克洛），第三代頭孢菌素（頭孢噻肟、頭孢曲松）的敏感率在80.0%以上，而對(duì)氨芐西林、甲氧芐啶－磺胺甲口惡唑和四環(huán)素的敏感率較低，分別為78.1%、41.9%和34.3%。

三、連續(xù)4年流感嗜血桿菌對(duì)抗菌藥物的敏感性分析

連續(xù)4年流感嗜血桿菌對(duì)大多數(shù)測(cè)試抗菌藥物的耐藥率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

四、連續(xù)4年分離自門(mén)診和住院患者的流感嗜血桿菌對(duì)抗菌藥物的敏感性分析

連續(xù)4年分離自門(mén)診和住院患者的流感嗜血桿菌對(duì)大多數(shù)測(cè)試抗菌藥物的耐藥率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

五、β內(nèi)酰胺酶檢測(cè)結(jié)果

（一）β內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性菌 223株流感嗜血桿菌中產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性氨芐西林耐藥菌株（BLPAR）為35株，產(chǎn)酶檢出率為15.7%。

（二）β內(nèi)酰胺酶陰性菌 β內(nèi)酰胺酶陰性氨芐西林耐藥菌株（BLNAR）為20株，占9.0%，見(jiàn)表3。

表1 2008—2011年流感嗜血桿菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率和敏感率（%）。Table 1 The susceptibility of Haemophilus influenzae strains to various antimicrobial agents during 2008－2011（%）

表2 4年間分離自門(mén)診和住院患者的流感嗜血桿菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率和敏感率（%）。Table 2 The suscetibility of Haemophilus influenzae isolated from outpatients and inpatients to antimicrobial agents during 4 consecutive years（%）

表3 4年間β內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性和β內(nèi)酰胺酶陰性氨芐西林耐藥的流感嗜血桿菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率和敏感率（%）Table 3 The susceptibility ofβ－lactamase－positive andβ－lactamase－negative ampicillin resistant Haemophilus influenzae strains to antimicrobial agents during 4 consecutive years（%）

討 論

本次統(tǒng)計(jì)中流感嗜血桿菌對(duì)氨芐西林不敏感率為21.9%，4年間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），略低于2010年中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)（35.7%）［1］。對(duì)氨芐西林耐藥的流感嗜血桿菌在1973年被首次報(bào)道，產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶是其主要耐藥機(jī)制。編碼β內(nèi)酰胺酶的基因主要在質(zhì)粒上，但也有些基因整合于細(xì)菌的染色體上，產(chǎn)生了2種β內(nèi)酰胺酶：TEM－1和 ROB－1，以 TEM－1比較常見(jiàn)，而幾乎所有產(chǎn)ROB－1酶的菌株出現(xiàn)在北美［2］。產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶的比率因地域分布而不同，如俄羅斯為4.2%，美國(guó)則為29.6%［3］。

β內(nèi)酰胺酶陰性氨芐西林耐藥，或者β內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性，阿莫西林－克拉維酸耐藥是由于青霉素結(jié)合蛋白（PBP）的改變，二型和未分型的菌株是由PBP3介導(dǎo)的，PBP3由ftsI基因整合［4］。根據(jù)2012 CLSI的規(guī)定，BLNAR應(yīng)評(píng)價(jià)為對(duì)于這些菌株：阿莫西林－克拉維酸、氨芐西林－舒巴坦、頭孢克洛、頭孢他美、頭孢尼西、頭孢丙烯、頭孢呋辛、氯碳頭孢，頭孢孟多以及哌拉西林－他唑巴坦均視為耐藥，即使一些BLNAR株體外試驗(yàn)顯示對(duì)這些藥物敏感也應(yīng)視為耐藥。

超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBL），是由TEM－1變異而來(lái)的，但是在流感嗜血桿菌中還未發(fā)現(xiàn)，盡管已經(jīng)在克隆株上有表達(dá)［5］，現(xiàn)已報(bào)道由2例南非患者體內(nèi)分離的副流感嗜血桿菌是產(chǎn)ESBL的［6］。

流感嗜血桿菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥率在過(guò)去30年里一直沒(méi)有改變，盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了少量高耐藥株［7－8］。

流感嗜血桿菌對(duì)喹諾酮類抗菌藥物耐藥非常罕見(jiàn)，廣譜喹諾酮類抗菌藥物通過(guò)干擾DNA復(fù)制而發(fā)揮抗菌作用，編碼DNA解螺旋酶或者拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的耐藥決定區(qū)的改變導(dǎo)致流感嗜血桿菌對(duì)喹諾酮藥物耐藥。喹諾酮類藥物由于其不良反應(yīng)目前不推薦給兒童使用。但是一項(xiàng)監(jiān)測(cè)表明，一些喹諾酮類藥物MIC值在增加，并且在一個(gè)長(zhǎng)期護(hù)理的設(shè)備上發(fā)現(xiàn)了1株高耐藥的克隆株［9］。相反，其對(duì)甲氧芐啶－磺胺甲口惡唑的耐藥率在過(guò)去的20年間不斷上升，2003年比利時(shí)為8.5%，肯尼亞為55.2%［3］，2010年我國(guó)為64.5%［1］，我院為57.1%。

同樣，流感嗜血桿菌對(duì)四環(huán)素的耐藥率較高，四環(huán)素類抗菌作用是藥物結(jié)合到細(xì)菌核糖體的30S并阻止tRNA接合到A和P位點(diǎn)上［10］。對(duì)四環(huán)素的耐藥性是由于流感嗜血桿菌的細(xì)胞膜上的tet（B）基因產(chǎn)生的外排機(jī)制，這種基因位于接合質(zhì)粒上［11－12］。tet（B）基因編碼的外排蛋白可以對(duì)四環(huán)素和米諾環(huán)素耐藥。由氨芐西林、卡那霉素的耐藥基因介導(dǎo)的質(zhì)粒經(jīng)常轉(zhuǎn)移到四環(huán)素上，導(dǎo)致其耐藥，這一現(xiàn)象已在比利時(shí)、西班牙和古巴分離的B型流感嗜血桿菌中報(bào)道［13－14］。流感嗜血桿菌對(duì)四環(huán)素和氯霉素的耐藥性增高，與質(zhì)粒介導(dǎo)的氨芐西林、氯霉素、四環(huán)素、卡那霉素耐藥基因有關(guān)。根據(jù)2012 CLSI標(biāo)準(zhǔn)，如果細(xì)菌對(duì)四環(huán)素耐藥，同時(shí)也對(duì)強(qiáng)力霉素和米諾環(huán)素耐藥。

從我院分離的流感嗜血桿菌4年來(lái)對(duì)頭孢噻肟、氯霉素和四環(huán)素的耐藥率有所降低，說(shuō)明醫(yī)師應(yīng)用抗菌藥物合理。但由于我國(guó)流感嗜血桿菌分離率較低，尚未對(duì)該菌造成的感染及其耐藥性引起重視，如果不合理使用抗菌藥物的現(xiàn)象持續(xù)下去，將會(huì)有高耐藥株出現(xiàn)［15］。

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