廣東省東莞地區(qū)發(fā)現(xiàn)1株泛耐藥產(chǎn)KPC－2型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌

張 麗，張小兵，楊維青，黃 娟，張麗華，張菊芬，朱學(xué)海，朱凱欣，周 靜

肺炎克雷伯菌是醫(yī)院感染的常見(jiàn)病原菌之一，其耐藥的主要原因是細(xì)菌產(chǎn)生質(zhì)粒介導(dǎo)的β內(nèi)酰胺酶，主要是產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶和質(zhì)粒AmpC酶，有些菌株2種酶同時(shí)存在，導(dǎo)致對(duì)多種抗菌藥物耐藥［1］。隨著碳青霉烯類抗生素的大量使用，出現(xiàn)了對(duì)其耐藥的肺炎克雷伯菌。國(guó)內(nèi)報(bào)道臨床分離的碳青霉烯類抗生素耐藥的腸桿菌科細(xì)菌，其主要耐藥機(jī)制是產(chǎn)KPC－2型碳青霉烯酶，以華東地區(qū)報(bào)道的較多［2］。日前，我院在1例ICU患者的痰液中分離到泛耐藥產(chǎn)KPC－2β內(nèi)酰胺酶的肺炎克雷伯菌，現(xiàn)報(bào)道如下。

材料與方法

一、材料

（一）菌株來(lái)源 中山大學(xué)附屬東華醫(yī)院ICU患者的痰標(biāo)本中分離到1株肺炎克雷伯菌。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌 ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603、產(chǎn)KPC－2型的質(zhì)控菌2105（由復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院抗生素研究所胡付品博士惠贈(zèng)）。

（二）主要儀器與試劑 VITEK2全自動(dòng)細(xì)菌分析鑒定系統(tǒng)為法國(guó)生物梅里埃公司產(chǎn)品。藥敏紙片亞胺培南（10μg）、美羅培南（10μg）、阿米卡星（30μg）、左氧氟沙星（5μg）、環(huán)丙沙星（5μg）、哌拉西林（100μg）、哌拉西林－他唑巴坦（100－10 μg）、氨曲南（30μg）、頭孢他啶（30μg）、頭孢曲松（30μg）、頭孢吡肟（30μg）、頭孢西丁（30μg）、甲氧芐啶－磺胺甲口惡唑（1.25－23.75μg）及藥敏 MH培養(yǎng)基購(gòu)自英國(guó)OXOID公司。PCR儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品。DYY－6C型電泳儀、WD－9403C紫外儀為北京市六一儀器廠。細(xì)菌質(zhì)粒提取試劑盒、PCR檢測(cè)試劑盒均為大連寶生物科技有限公司 產(chǎn) 品。引 物［3］blakpcF5′－GCT ACA CCT AGC TCC ACC TTC－3′blakpc R5′－ACA GTG GTT GGT AAT CCA TGC－3′由生工生物工程（上海）有限公司合成。

二、方法

（一）菌株分離與鑒定 按常規(guī)方法從臨床標(biāo)本分離細(xì)菌，獲純培養(yǎng)后進(jìn)行革蘭染色和氧化酶試驗(yàn)，根據(jù)革蘭染色和氧化酶結(jié)果選擇革蘭陰性鑒定卡，在VITEK2全自動(dòng)微生物分析儀上進(jìn)行菌種鑒定，操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

（二）藥敏試驗(yàn) 選用K－B紙片瓊脂擴(kuò)散法，挑取一定量細(xì)菌配成0.5麥?zhǔn)媳葷岬木海鶆蛲坎加贛H平皿上，室溫干燥3～5 min。貼細(xì)菌藥敏紙片，各紙片中心大于24 mm，紙片距離平皿邊緣應(yīng)大于15 mm。置35℃孵育16～18 h后讀取結(jié)果，參照 CLSI 2011年版標(biāo)準(zhǔn)判讀［4］。

（三）耐藥表型檢測(cè) 采用改良的Hodge試驗(yàn)檢測(cè)待檢菌的耐藥表型［4］。用大腸埃希菌ATCC 25922以生理鹽水制備0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)菌懸液，按常規(guī)K－B法程序接種MH平皿，使平皿干燥5 min，在直徑90 mm平皿中央放置亞胺培南（10μg）紙片1張。然后使用10μL接種環(huán)挑取在血平皿過(guò)夜生長(zhǎng)的3～5個(gè)試驗(yàn)菌落，從紙片邊緣向外劃直線接種。劃線至少25 mm長(zhǎng)，孵育24 h后，檢查 MH平皿，在抑菌環(huán)與試驗(yàn)菌株交叉處是否出現(xiàn)增強(qiáng)生長(zhǎng)。

（四）模板制備與PCR擴(kuò)增及測(cè)序 煮沸裂解法制備模板DNA，PCR篩選KPC－2基因，所用引物及方法參照文獻(xiàn)［3］。PCR法擴(kuò)增KPC－2基因的反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃5 min，變性94℃30 s，退火52℃30 s，延伸72℃1 min，共35個(gè)循環(huán)，再延伸72℃7 min，4℃保存10 min，即可電泳檢驗(yàn)結(jié)果。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，將1μL的核酸染料（將原液用0.5×TBE電泳緩沖液稀釋10倍）與5μL的Marker2000混勻取3μL加入凝膠孔中作參照；將1μL核酸染料、1μL的6×Loading buffer和4μL的PCR產(chǎn)物混勻取3μL上樣。110 V電泳35 min，溴化乙靛染色15 min，洗脫后放凝膠成像系統(tǒng)成象，觀察結(jié)果。以肺炎克雷伯菌ATCC700603作陰性對(duì)照，KPC－2陽(yáng)性菌株2105作陽(yáng)性對(duì)照。產(chǎn)物經(jīng)純化、膠回收后由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，結(jié)果在GenBank網(wǎng)上查詢比對(duì)。

結(jié) 果

一、細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)

經(jīng)鑒定該菌為肺炎克雷伯菌，細(xì)菌鑒定可信度99%。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，除對(duì)阿米卡星敏感外，對(duì)亞胺培南 、美羅培南、哌拉西林－他唑巴坦和其他常用抗菌藥物均耐藥。

二、改良Hodge試驗(yàn)檢測(cè)待檢菌的耐藥表型

大腸埃希菌（ATCC25922）抑菌環(huán)與痰標(biāo)本分離到泛耐藥肺炎克雷伯菌在交叉處出現(xiàn)增強(qiáng)生長(zhǎng)，而對(duì)照菌株在交叉處未出現(xiàn)增強(qiáng)生長(zhǎng)。見(jiàn)圖1。

三、PCR擴(kuò)增及測(cè)序

PCR產(chǎn)物GenBank Blast程序分析，該序列與KPC－2（GenBank11844849號(hào)）的核苷酸序列同源性為100%。PCR擴(kuò)增檢測(cè)到KPC－2基因，序列長(zhǎng)度為920 bp。見(jiàn)圖2。

圖1 產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌Hodge試驗(yàn)結(jié)果Figure 1 Results of Hodge test for production of KPC－2 carbapenemase in Klebsiella pneumoniae

圖2 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Figure 2 Results of electrophoresis for PCR products

四、臨床病史調(diào)查分析

該患者男性，52歲，因“鼻咽癌放療后17年余，咳嗽2 d，高熱1 d”入住我院ICU。入院診斷：①社區(qū)獲得性肺炎（重癥），急性呼吸衰竭；②血流感染（肺炎鏈球菌），膿毒性休克；③支氣管擴(kuò)張。入院后予以嚴(yán)密監(jiān)測(cè)生命體征，積極抗感染治療等處理，并行氣管插管、機(jī)械通氣治療。曾用頭孢他啶、哌拉西林－他唑巴坦、左氧氟沙星、亞胺培南等抗菌藥物。2012年3月8日，痰培養(yǎng)示泛耐藥肺炎克雷伯菌，予替加環(huán)素和阿米卡星抗感染，停用呼吸機(jī)，入住隔離病房，加強(qiáng)支持治療后，1個(gè)月內(nèi)2次痰培養(yǎng)均未檢出肺炎克雷伯菌。

討 論

碳青霉烯類抗生素對(duì)革蘭陰性菌的抗菌譜廣，抗菌活性強(qiáng)，是治療醫(yī)院嚴(yán)重感染常用藥，尤其適用于產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶或AmpC酶腸桿菌科細(xì)菌的嚴(yán)重感染。隨著碳青霉烯類抗生素在臨床上廣泛使用，出現(xiàn)了耐藥菌株。目前，引起腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類耐藥的最常見(jiàn)原因是碳青霉烯酶的產(chǎn)生，尤其以產(chǎn)KPC酶最為常見(jiàn)。KPC酶最早在1株亞胺培南耐藥的肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)，是一種新型碳青霉烯酶，屬于Bush分類的A組2f亞組絲氨酸酶。此類酶能夠水解碳青霉烯類、青霉素類、頭孢菌素類和氨曲南等抗生素，克拉維酸對(duì)酶活性作用不確定［3］。目前發(fā)現(xiàn)11個(gè)KPC亞型，并在美國(guó)，特別是美國(guó)東北部各州蔓延，造成局部暴發(fā)和流行［5］；在我國(guó)，產(chǎn) KPC－2酶的細(xì)菌以華東地區(qū)報(bào)道較多［2］。回顧東莞地區(qū)以往的耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，未發(fā)現(xiàn)耐碳青霉烯類的腸桿菌科細(xì)菌［6－7］。此次發(fā)現(xiàn)的1株耐碳青霉烯類抗生素的肺炎克雷伯菌經(jīng)過(guò)PCR檢測(cè)，其耐藥基因及測(cè)序發(fā)現(xiàn)為產(chǎn)KPC－2型碳青霉烯酶，與我國(guó)其他地區(qū)報(bào)道的型別相同［2］。

碳青霉烯類抗生素耐藥腸桿菌科細(xì)菌往往對(duì)臨床常用的抗菌藥物呈現(xiàn)耐藥。胡付品等［2］報(bào)道的中國(guó)CHINET2010年監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，碳青霉烯類抗生素耐藥腸桿菌科細(xì)菌除對(duì)阿米卡星和米諾環(huán)素的耐藥率分別為52.6%和37.0%外，對(duì)其他抗菌藥物的耐藥率均在70.0%～100%。Hirsch等［8］報(bào)道，治療由碳青霉烯類抗生素耐藥腸桿菌科細(xì)菌引起的感染，可選用氨基糖苷類聯(lián)合黏菌素或替加環(huán)素的治療方案。本研究發(fā)現(xiàn)，該肺炎克雷伯菌除對(duì)阿米卡星敏感外，對(duì)其他測(cè)試抗菌藥物均耐藥。臨床根據(jù)藥敏結(jié)果改用替加環(huán)素聯(lián)合阿米卡星，并拔除氣管插管及對(duì)癥處理后，病情好轉(zhuǎn)，且1個(gè)月內(nèi)連續(xù)2次痰培養(yǎng)均未檢出肺炎克雷伯菌。

Patel等［9］的研究表明，患者免疫狀態(tài)、入住ICU、長(zhǎng)期住院以及廣譜抗菌藥物的應(yīng)用是導(dǎo)致醫(yī)院內(nèi)碳青霉烯類抗生素耐藥肺炎克雷伯菌感染或定植的危險(xiǎn)因素。本次是在1例入住ICU，免疫功能低下的鼻咽癌化療患者中分離出該菌株，臨床依據(jù)實(shí)驗(yàn)室結(jié)果合理應(yīng)用抗生素及對(duì)癥治療后，細(xì)菌培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰，也未引起醫(yī)院內(nèi)播散。

因此，臨床依據(jù)藥敏結(jié)果合理使用抗菌藥物、加強(qiáng)醫(yī)院感染控制措施，可遏制耐藥菌株的產(chǎn)生和播散。

［1］ 胡付品，葉信予，吳培澄，等.2005年上海華山醫(yī)院細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)［J］.中國(guó)感染與化療雜志，2007，7（4）：332－337.

［2］ 胡付品，朱德妹，汪復(fù)，等.CHINET監(jiān)測(cè)2010年碳青霉烯類抗生素耐藥腸桿菌科細(xì)菌的分布特點(diǎn)和藥物敏感性［J］.中國(guó)感染與化療雜志，2013，13（1）：1－7.

［3］ Smith Moland E，Hanson ND，Herrera VL，et al.Plasmid－mediated，carbapnem－h(huán)ydrolysingβ－lactamase，KPC－2，in Klebsiella pneumoniaeisolates［J］.J Antimicrob Chemother，2003，51（3）：711－714.

［4］ Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing［S］.Twentieth Informational Supplement，2011，M100-S21.

［5］ Woodford N，Tierno PM Jr，Young K，et al.Outbreak ofKlebsiella pneumoniae producing a new carbapenem—hydrolyzing class A beta－lactamase，KPC－3，in a New York Medical Center［J］.Antimicrob Agents Chemother，2004，48（12）：4793－4799.

［6］ 張麗華，張麗，李超強(qiáng)，等.東莞東華醫(yī)院2007年細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)［J］.中國(guó)感染與化療雜志，2008，8（5）：379－382.

［7］ 張麗，張麗華，張小兵.2009年中山大學(xué)附屬東華醫(yī)院細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)［J］.中國(guó)感染與化療雜志，2011，11（5）：375－380.

［8］ Hirsch EB，Tam VH.Detection and treatment options for Klebsiella pneumoniae carbapenemases（KPCs）：an emerging cause of multidrug－resistant infection［J］.J Antimicrob Chemother，2010，65（6）：1119－1125.

［9］ Patel G，Huprikar S，F(xiàn)actor SH，et al.Outcomes of carbapenem－resistant Klebsiella pneumoniae infection and the impact of antimicrobial and adjunctive therapies［J］.Infect Control Hosp Epidemiol，2008，29（12）：1099－1106.