Eph A2在膀胱癌中的表達(dá)及意義

張東東,扈清云,王培軍,歐葉濤,韓 曦,陳乃峰,尹興忠,鐘堂武,梁衍鋒

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007)

膀胱癌是一種最常見(jiàn)的原發(fā)于膀胱上皮細(xì)胞的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤,其惡性程度和復(fù)發(fā)率較高。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致膀胱癌的原因有很多,其中基因和生活環(huán)境尤為主要。通過(guò)以往的研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)膀胱細(xì)胞內(nèi)一個(gè)或多個(gè)抗癌基因的失活或癌基因的激活膀胱癌的發(fā)生主要因素。因此,我們通過(guò)分子遺傳學(xué)研究膀胱癌不僅有助于膀胱癌的發(fā)病機(jī)制及膀胱腫瘤基因的研究,而且對(duì)膀胱腫瘤的診斷及預(yù)后均有著十分重要的指導(dǎo)意義。本實(shí)驗(yàn)主要研究的是 EphA2(erythropoietin producing hepatoma cell line A2),EphA2是 EphA亞家族受體8個(gè)成員中的第2個(gè)[1,2]。在人的多種細(xì)胞系或組織中都有 EphA2表達(dá)。人類 EphA2基因位于染色體1p36.1上,其含有 17個(gè)外顯子。EphA2能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增生主要體現(xiàn)在:EphA2的過(guò)度表達(dá)時(shí)能使正常細(xì)胞發(fā)生變異[3],正常情況下當(dāng) EphA2與配體結(jié)合后,削弱誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)的生長(zhǎng)因子活性,從而抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此當(dāng) EphA2正常表達(dá)時(shí)可抑制細(xì)胞發(fā)生增生,異常表達(dá)時(shí)則可以促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。本次實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)法和 RT-PCR法檢測(cè)正常膀胱組織與膀胱癌組織中的 EphA2異常表達(dá)率,通過(guò)本次試驗(yàn)分析正常膀胱組織和膀胱癌組織中 EphA2表達(dá),觀察蛋白水平和基因水平表達(dá)的相互關(guān)系,能為膀胱癌在其發(fā)病、診斷治療以及臨床預(yù)后提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)材料來(lái)自于佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,其中正常膀胱組織新鮮的10例,膀胱癌組織新鮮的31例,此外還有膀胱癌石蠟組織標(biāo)本40例。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

瓊脂糖,DEPC液,枸櫞酸緩沖液,DAB顯色試劑盒,兔抗人 EphA2多克隆抗體,2000bpMarker,PBS緩沖液,Taq DN A聚合酶,引物,Trizol,GAPDH,SABC試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司),RNA提取試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)有限公司),反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (寶生物工程(大連)有限公司)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 1RT-PCR法:實(shí)驗(yàn)前將所有使用器具用濃硫酸和DEPC水浸泡,高溫高壓消毒,烘干保存。

1.3.2 提取正常膀胱組織和膀胱癌組織的 RN A并檢測(cè):首先使用勻漿器將癌組織和正常膀胱組織進(jìn)行勻漿處理,其次將勻漿后的組織加入提取液離心,最后加 RNA抑制酶離心后保存。使用凝膠電泳檢測(cè)提取的 RN A是否完整。

1.3.3 反轉(zhuǎn)錄:將提取到的 mRN A進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)的cDN A并對(duì)其擴(kuò)增。

1.3.4 RT-PCR:制備標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

1.3.5 將 RT-PCR實(shí)驗(yàn)所得凝膠利用天能 GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)對(duì)進(jìn)行分析,得出數(shù)據(jù)。

1.4 免疫組化(SABC)法

本實(shí)驗(yàn)標(biāo)本包括新鮮組織標(biāo)本和膀胱癌石蠟組織標(biāo)本,先將新鮮組織標(biāo)本進(jìn)行固定后脫水形成石蠟標(biāo)本。將所有石蠟組織切片常規(guī)免疫組化處理加入兔抗人 EphA2多克隆抗體封片計(jì)數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用 SPSS16.0軟件對(duì)所得出的數(shù)據(jù)進(jìn)行 t檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn),P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR法 EphA2的檢測(cè)

通過(guò) RT-PCR法檢測(cè)發(fā)現(xiàn) EphA2在膀胱癌組織中的表達(dá)明顯高于正常膀胱組織的表達(dá)。

表1 RT-PCR法檢測(cè) Eph A2在正常膀胱組織和膀胱癌組織的表達(dá)

2.2 免疫組化 EphA2的檢測(cè)

EphA2免疫組化陽(yáng)性物質(zhì)呈棕黃色,EphA2免疫染色定位在膀胱細(xì)胞膜和細(xì)胞漿,在正常膀胱黏膜上皮中,EphA2呈陰性或弱陽(yáng)性表達(dá)。而當(dāng)膀胱發(fā)生癌癥病變時(shí)會(huì)隨著癌癥的分化高低的不同而改變。分化越高表達(dá)越低,分化越低表達(dá)越高。通過(guò)免疫組化法發(fā)現(xiàn)在膀胱癌組織中 EphA2的異常率表達(dá)為77.46%(55/71),正常膀胱黏膜組織異常率的表達(dá)為20%,EphA2在膀胱癌組織中的異常表達(dá)率明顯高于正常組織 (P ＜ 0.01)。

表2 免疫組化(SABC)法分析 EphA2在正常膀胱組織和膀胱癌組織的表達(dá)

3 討論

在研究發(fā)現(xiàn) EphA2對(duì)細(xì)胞的增生具有一定的調(diào)節(jié)作用[4,5]。通過(guò)在蛋白水平研究表明 EphA2在膀胱移行細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn):當(dāng) EphA2在正常表達(dá)情況下可抑制細(xì)胞增生,而異常表達(dá)時(shí)可以促進(jìn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。本實(shí)驗(yàn)采用 RT-PCR法以及免疫組織化學(xué)技術(shù),檢測(cè)了71例膀胱移行細(xì)胞癌和10例正常膀胱組織的 EphA2的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn):在基因水平上膀胱移行細(xì)胞癌的 EphA2表達(dá)高于正常膀胱組織中的 EphA2表達(dá),利用免疫組織化學(xué)方法蛋白檢測(cè)膀胱移行細(xì)胞癌的EphA2表達(dá)高于正常膀胱組織中的 EphA2表達(dá),兩種檢測(cè)方法得出的結(jié)論一致。本研究得到:在膀胱移行細(xì)胞癌中EphA2的基因與蛋白有著重要的聯(lián)系,EphA2的基因決定了EphA2蛋白的表達(dá)。這一結(jié)果提示 EphA2在膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著十分重要的作用,從而為膀胱癌的發(fā)生、診斷和治療等提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

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