灰離褶傘菌中活性物質體外抗腫瘤實驗研究

李春豐,姜 蓓,田 寅

(1.佳木斯大學生命科學學院,黑龍江 佳木斯 154007;2.佳木斯大學附屬第一醫院,黑龍江 佳木斯 154003)

食用菌是真菌中的可以食用或藥用菇體種類的總稱,具有肉質子實體。食用菌中含有生物活性物質對維護人體健康有重要的利用價值。以食用菌為原料生產加工的保健食品和藥品用于醫療臨床及投入保健品市場。因此,食用菌作為一種綠色食品受到各國人民的重視。食用菌不僅味美,而且營養豐富,常被人們稱作健康食品,還具藥用保健價值;降低血液中的膽固醇、治療高血壓的作用,還發現含有增強人體抗癌能力的物質。灰離褶傘。隸屬于真菌門、同擔子菌亞綱、傘菌目、白蘑科、離褶傘屬,別名:塊根蘑,俗稱一窩雞 ,我國一般多產于黑龍江、吉林、云南、西藏一帶。灰離褶傘一般在夏末到秋季間生長,灰離褶傘喜好群生或者叢生,此種菌肉肥厚,味道鮮美,屬優良食菌,可人工栽培。灰離褶傘是一種具有食藥用價值的真菌,含有豐富的蛋白質、人體必需氨基酸、糖類、多種維生素營養素等有效成分,可治消化不良、胃腸脹滿等。灰離褶傘具有較好的民間應用基礎,臨床治療腫瘤也有較滿意的療效。具抗癌作用。為了探究灰離褶傘活性物質的抗腫瘤活性,本文在實驗室自制灰離褶傘活性物質的基礎上,進一步進行離子交換層析和凝膠過濾層析得到活性物質,并對兩種活性物質進行了體外抑癌實驗,為灰離褶傘的臨床應用提供科學依據,現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

灰離褶傘活性物質,由本實驗室制備。細胞株供試瘤株為大腸癌 HT29、人胃癌細胞株 BGC823佳木斯大學動物實驗中心惠贈。主要試劑甲醇、乙醚、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、香草醛顯色劑、無水乙醇、環磷酰胺、濃硫酸等。硫酸顯色劑、胰酶與 EDTA消化液、M TT等。主要儀器:高速低溫離心機,薄層層析硅膠板,電子分析天平 、超低溫冰箱、96孔培養板、倒置相差顯微鏡、超凈工作臺、CO2培養箱、酶標儀等。

1.2 方法

1.2.1 灰離褶傘活性物質提取方法

粉碎后的灰離褶傘子實體,用乙醇浸提濃縮。用乙酸乙酯和水溶解后,反復萃取,直至有機相無色,取有機相部分濃縮。將硅膠和石油醚混合 ,裝入層析柱 ,石油醚為流動相,接樣,直至柱內硅膠流實。有機相用硅膠拌樣,用石油醚浸潤,用滴管加到層析柱中。石油醚 /乙酸乙酯梯度洗脫,依次接樣,每瓶約 250mL,然后蒸樣濃縮 ,得70瓶。分別用薄層層析檢板,合并相似的組分。對各個組分分別繼續提純。

1.2.2 處理液的配制

試驗前用 RPMI-1640液溶解 ,分別配成 1.5 μg/mL、15 μg/mL、150 μg/mL的溶液 ,無菌過濾 ,備用。

1.2.3 細胞培養方法

將腫瘤細胞用貼壁細胞培養方法,HT29和 BGC823細胞用 RPMI-1640營養液培養,消化呈單個細胞,稀釋、計數,每2天換液1次,加足營養液進行培養。按1:2比例傳代,3～4d傳代1次,收集對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.4 改良 M TT法

取對數生長期形態佳的兩種瘤細胞。用0.25%胰酶和0.02%ETDA(1:1)消化液,消化分散成單個細胞,計數,稀釋成 1～5× 104個 /mL,加入 96孔培養板每孔 200μL,置 5%CO2、37℃的培養箱中培養24h,然后加已稀釋好的灰離褶傘提取物,陰性對照用相應培養液代之,陽性對照用環磷酰胺,20μL/孔 ,再 繼 續培養 48h。取 HT29和 BGC823細胞 采 用M TT法,藥物與細胞作用48h后,吸去培養液,加入 M TT顯色,用酶標儀 (490nm波長)測出各孔光密度(OD)值。以光密度值(OD)表示細胞數量。抑制率%=(對照組 OD值-給藥組 OD值)/對照組 OD值×100%。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 灰離褶傘活性物質對 HT29細胞生長的影響

從表1中可以看出,灰離褶傘活性物質對大腸癌 HT29細胞的抑制率均隨著多糖濃度的增大而增大。說明灰離褶傘活性物質對 HT29細胞增殖的抑制作用有一定的劑量依賴性。灰離褶傘活性物質處理組的 M TT檢測 OD值與陰性對照組間無顯著差異外,其余各組的 M TT檢測 OD值均顯著或極顯著低于陰性對照組。見表1。

表1 灰離褶傘活性物質對 HT29細胞生長的抑制作用

2.2 灰離褶傘活性物質對 BGC823細胞生長的影響

從表2中可以看出,灰離褶傘活性物質對人胃癌細胞株BGC823細胞的抑制率均隨著多糖濃度的增大而增大。說明灰離褶傘活性物質 BGC823細胞增殖的抑制作用有一定的劑量依賴性。灰離褶傘活性物質處理組的 M TT檢測 OD值與陰性對照組間無顯著差異外,其余各組的 M TT檢測 OD值均顯著或極顯著低于陰性對照組。見表2。

表2 灰離褶傘活性物質對 BGC823細胞生長的抑制作用

3 討論

本試驗用灰離褶傘活性物質對兩種腫瘤細胞 HT29和BGC823進行體外試驗 ,用 M TT法測定細胞的增殖抑制率,表明灰離褶傘活性物質對大腸癌 HT29、人胃癌細胞株BGC823兩種腫瘤細胞均有較強的抑制作用,且其抑制率與濃度呈良好的量效關系。根據試驗結果進行推測,其抗癌的機制可能是通過提高機體免疫功能而間接的影響癌細胞,抑制細胞的增殖,為進一步研究和開發白頭翁抗腫瘤藥物提供理論依據。

[1]戴芳瀾.中國真菌總匯[M].北京:科學出版社,1979,530

[2]劉國詮,余兆樓.色譜柱技術 [M].北京:化學工業出版社,2001,1-34

[3]何華,倪坤儀.現代色譜分析 [M].北京:化學工業出版社,2004,1-37

[4]全國中草藥匯編編委.全國中草藥匯編(下冊)[M].北京:人民衛生出版社,1978,403

[5]李宜明,沈業壽,季俊虬.桑黃菌質多糖體外抑瘤及抗環磷酰胺致突變的作用 [J].中國科學技術大學學報,2006,36(7):700-703

[6]卜書紅,李方,田懷平.M T T比色法進行體外腫瘤藥敏實驗的影響因素 [J].北京醫學,2002,24(5):29