GDNF在大鼠急性脊髓損傷中的表達(dá)及變化規(guī)律

周成福,南 鵬,馬曉茹

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨外科,黑龍江 佳木斯 154003;2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007)

膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(glial cell linederived neurot rophic factor,GDNF)由 Lin等在1993年從大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系 B49的培養(yǎng)液中首先純化并命名[1]。研究表明,GDNF是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β且超家族成員的新型神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,最近己發(fā)現(xiàn)其對(duì)培養(yǎng)的 DA神經(jīng)元、脊髓和周?chē)\(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、交感覺(jué)神經(jīng)元等多種神經(jīng)元都具有促進(jìn)生長(zhǎng)及保護(hù)作用,是目前發(fā)現(xiàn)的活性最強(qiáng)的神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子[2]。GDNF在大部分脊髓組織中有廣泛的分布,大多數(shù)脊髓組織中廣泛存在的膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子免疫組化檢測(cè),可發(fā)現(xiàn)在脊髓后角中 GDN F有免疫活性。GDN F在大鼠胚與胎時(shí)期廣泛高表達(dá)于腦脊髓說(shuō)明其對(duì)該類組織的發(fā)育與分化起營(yíng)養(yǎng)作用,出生后在神經(jīng)組織及其靶組織表達(dá)明顯降低,成年大鼠則表達(dá)甚微。脊髓損傷后 GDNF的變化及規(guī)律沒(méi)有提出明確研究。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化測(cè)定大鼠脊髓損傷后 0h、 2h、 12h、48h、72h脊髓組織 GDN F的含量 ,并與對(duì)照組進(jìn)行比較分析,意在探討 GDN F在脊髓損傷時(shí)的動(dòng)態(tài)變化并為判斷脊髓損傷提供臨床依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

健康成年 Wistar大鼠56只(佳木斯大學(xué)動(dòng)物中心飼養(yǎng),大連醫(yī)科大學(xué)購(gòu)買(mǎi)),雌雄不限 ,體重200～300g。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。動(dòng)物室內(nèi)自然光照單獨(dú)飼養(yǎng)。室溫保持24℃,噪音 (30±15)bd,全密閉式自然排風(fēng)。飼以營(yíng)養(yǎng)均衡飼料,保證飲水和食物,除實(shí)驗(yàn)因素外,不受其他任何不良影響。

1.2 大鼠脊髓損傷模型制作

損傷組采用改良 Allen[3]法制備大鼠脊髓損傷模型,以10%水合氯醛(0.3mL/100g)腹腔注射麻醉(戴手套以左手食指和拇指抓住大鼠頸后皮膚比較松弛的地,大小魚(yú)際夾住大鼠尾部組織,使大鼠仰臥位選擇左下或右下腹腔進(jìn)針,回抽無(wú)血后注入),給予青霉素20單位左下肢肌肉注射后,俯臥位固定與操作臺(tái)上,背部去除毛,常規(guī)術(shù)區(qū)碘伏消毒,鋪無(wú)菌單,背部正中切口 (T10～ T12),鈍性向下分離筋膜及椎旁肌肉,顯露棘突后用咬骨鉗去除棘突 ,打開(kāi)椎板 ,暴露 T11、T12硬膜囊,用10g的重錘自10cm處沿瞄準(zhǔn)器垂直打擊放置在硬模上直徑2mm的墊片上,造成外傷性脊髓損傷[4,5]見(jiàn)脊髓組織出現(xiàn)腫脹、出血 ,甚至斷裂,大鼠出現(xiàn)擺尾反射,雙下肢及軀體回縮撲動(dòng)后自然松弛,雙后肢遲緩性癱瘓,表明撞擊成功急性脊髓損傷模型造模成功。術(shù)后清潔切口,以消毒溫鹽水沖洗損傷脊髓及創(chuàng)口后縫合肌肉,筋膜皮下組織及皮膚。清洗傷口周?chē)E,防止大鼠感染等其他不可知因數(shù),影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。等待大鼠麻醉蘇醒后分別獨(dú)自喂養(yǎng),補(bǔ)充大量葡萄糖后,給予均衡飼料喂養(yǎng),清潔溫水,吹風(fēng)機(jī)保暖 (大鼠在麻醉蘇醒后和高位脊髓損傷可導(dǎo)致致低體溫及低血壓如處理不當(dāng)大鼠死亡率較高),術(shù)后蘇醒肌肉注射青霉素20單位日一次持續(xù)3d,每日溫水清洗后肢及下腹部并擦干,2～3h1次,避免感染及壞死。每日按摩膀胱促進(jìn)排尿2次 ,適時(shí)更換鼠籠中的木屑[4,5]。避免動(dòng)物因感染、二便障礙導(dǎo)致其死亡,術(shù)后3d之內(nèi)觀察大鼠的狀態(tài)如下肢活動(dòng)功能進(jìn)食排便,注意防止大鼠發(fā)生擠壓死亡,嚴(yán)密觀察大鼠切口,預(yù)防性擦拭碘伏。對(duì)照組采取同前方法咬開(kāi)椎板后不損傷脊髓后給予縫合。

1.3 動(dòng)物分組

動(dòng)物隨機(jī)分為7組,正常組和假手術(shù)組,其中6組制成急性脊髓損傷模型,1組作為對(duì)照組。

1.4 標(biāo)本采集,制備和保存

分別于手術(shù)后 0h、2h、 12h、 24h、 48h、 72h自背部打開(kāi)椎管,顯露 T11、T12受傷脊髓,見(jiàn)脊髓組織腫脹出血壞死,變性如豆腐渣樣,切取損傷節(jié)段和相鄰頭尾部節(jié)段長(zhǎng)約7mm脊髓,置于三蒸水中清洗去除血跡,后給予4%多聚甲醛緩沖液里固定 ,存放于4℃冰箱過(guò)夜,脫水,石蠟包埋,制作成標(biāo)本蠟塊,冠狀面連續(xù)切片,厚度5μm。

1.5 免疫組化

每組取8張切片分別行 GDNF檢測(cè),選擇脊髓組織完整石蠟載玻片上依次滴加一抗、二抗、三抗然后滴加顯色底物,DAB色素混合物。所用試劑和儀器為小鼠抗人 GDNF抗體、ABC試劑盒、DAB顯色劑、DAB染色劑。免疫組化檢測(cè)SABC法和 DAB染色。GT-120A全自動(dòng)生物組織脫水機(jī)(上海市宇騰電子儀器有限公司);GT-100病理石蠟包埋機(jī)(上海市宇騰電子儀器有限公司);GT-98石蠟包埋冷凍機(jī)(上海市宇騰電子儀器有限公司);GT-2745A石蠟切片機(jī);DT-90A攤烘烤片機(jī)(上海宇騰電子儀器有限公司);SIM bs-31恒溫水浴箱;Metamoph Image System(UIC,美國(guó) )DP10/Olympus BX 51(日本)顯微攝影圖像分析系統(tǒng)。

1.6 圖像分析

光學(xué)顯微鏡100倍視野下可見(jiàn)正常組免疫組化切片可見(jiàn)脊髓后角組織中 GDNF陽(yáng)性灰度值顏色淺陽(yáng)性率低,假手術(shù)組可見(jiàn)脊髓后角灰度值及陽(yáng)性率明顯增多。應(yīng)用 Metamoph Image System(UIC,美國(guó) )/DP10/Olympus BX 51(日本 )顯微攝影圖像分析系統(tǒng),400倍視野下,在損傷灶周?chē)鄵p傷區(qū)200μ m范圍內(nèi)隨機(jī)選取5個(gè)視野,對(duì) GDNF免疫組織化學(xué)染色、原位雜交染色陽(yáng)性反應(yīng)物進(jìn)行定量檢測(cè),測(cè)定陽(yáng)性反應(yīng)物平均灰度,然后應(yīng)用 SPSS軟件下進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采集完采用 SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (± s)表示 ,進(jìn)行方差檢驗(yàn) t分析,P＜0.05表示有顯著差異。

2 結(jié)果

GDNF免疫組化染色結(jié)果:對(duì)照組及假手術(shù)組后0h組無(wú)特異陽(yáng)性染色,假手術(shù)組 GDNF表達(dá)2h可見(jiàn)陽(yáng)性率及灰度值明顯變化且陽(yáng)性率達(dá)到最高值,12h、24h、48h、有所改變GDNF的表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢(shì),72h幾乎接近對(duì)照組。可見(jiàn)脊髓損傷后 GDNF的變化2h脊髓立即啟動(dòng)應(yīng)急措施保護(hù)損傷脊髓進(jìn)行自我修復(fù)。這一變化規(guī)律可以作為臨床診斷脊髓損傷提供幫組和指導(dǎo)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn) GDN F的灰度值 (±s)

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn) GDN F的灰度值 (±s)

*具有顯著性差異 (P＜0.05)。

組別時(shí)間 0h 2h 12h 24h 48h 72h對(duì)照組 2.30± 0.29 2.27± 0.16 2.33± 0.13 2.33± 0.23 2.28± 0.15實(shí)驗(yàn)組 2.33± 0.33 12.21± 0.65* 8.97± 0.59* 6.35± 0.34* 4.35± 0.34* 2.50± 0.15

3 討論

脊髓損傷是世界性難題,每年給很多家庭帶來(lái)災(zāi)難性的損失經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致四肢肌力下降,運(yùn)動(dòng)障礙,感覺(jué)過(guò)敏高位脊髓損傷甚至危及生命,而脊髓損傷的最佳治療期在受傷的48h以內(nèi)。早期的治療不論是藥物(單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂、激素)還是手術(shù)的前提必須是明確是否為脊髓損傷和損傷的時(shí)期如損傷早期大劑量激素沖擊療法和后續(xù)的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂治療,現(xiàn)代的診療方法,包括受傷機(jī)制、體格檢查、影像學(xué)表現(xiàn)都是從各個(gè)方面來(lái)診斷脊髓損傷。帶來(lái)的是復(fù)雜、繁瑣、和不確定人為因素、價(jià)格的昂貴。我們?cè)噲D需找一種簡(jiǎn)潔、迅速、快捷、低廉的診斷手法來(lái)解決我們我遇到的困難。如炎癥反應(yīng)時(shí)白細(xì)胞應(yīng)急性升高,從這一思路而來(lái)我們也尋求一種可以有通過(guò)應(yīng)急反應(yīng)升高的特異性物質(zhì)來(lái)診斷脊髓損傷。哺乳動(dòng)物脊髓損傷(Spinalcordinjury,SCI)后感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)僅有非常小的機(jī)會(huì)恢復(fù),大部分不能恢復(fù)到損傷以前,因?yàn)樯窠?jīng)細(xì)胞為不可再生細(xì)胞,肢體的感覺(jué)及運(yùn)動(dòng)有所恢復(fù)大部分了來(lái)源于膠質(zhì)細(xì)胞,原因可能為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)不能提供的細(xì)胞生長(zhǎng)的條件,致使絕大部分神經(jīng)細(xì)胞的再生面臨死亡,其中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子不足以及神經(jīng)細(xì)胞的退變是不可缺少的的因素[6～8]。

哺乳動(dòng)物從出生到成熟過(guò)程中,神經(jīng)細(xì)胞再起過(guò)程起到了決定性的作用,而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在維護(hù)其生長(zhǎng)發(fā)育中充當(dāng)了重要角色,他們廣泛分布于神經(jīng)周?chē)?通過(guò)各種渠道,按一定的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯,作用于特定的神經(jīng)表面決定簇,發(fā)揮其特殊作用。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,新的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子不斷發(fā)現(xiàn),同時(shí)對(duì)它們的基因序列、分子構(gòu)成、分布特點(diǎn)、調(diào)控機(jī)制的研究也取得一定的研究成果。大量研究表明,脊髓損傷會(huì)引起神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的改變,諸如脊髓前動(dòng)脈的改變、離子平衡的改變以及代謝改變,這些改變可以直接對(duì)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用,神經(jīng)修復(fù)重建是目前研究的重點(diǎn)之一。研究發(fā)現(xiàn)其與神經(jīng)痛感覺(jué)過(guò)敏有關(guān)聯(lián),對(duì)損傷導(dǎo)致的細(xì)胞變性壞死有促進(jìn)其再生作用[9]。研究顯示,GDNF在腦缺血、帕金森氏病、肌萎縮側(cè)索硬化等原因造成的神經(jīng)損傷中具有明顯的保護(hù)作用[10]。本研究通過(guò)制備動(dòng)物急性脊髓損傷模型,采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)脊髓組織中不同時(shí)間點(diǎn) GDN F的表達(dá)情況。正常組中可見(jiàn)到 GDN F在大脊髓前角后角中低水平表達(dá);損傷后2h脊髓后角表達(dá)的GDNF達(dá)到高峰,12h后陽(yáng)性率開(kāi)始下降,24h、48h、持續(xù)下降,72h恢復(fù)到正常水平。GDN F通過(guò)目前我們已知和未知的方式。作用于特定相應(yīng)的神經(jīng)細(xì)胞群和細(xì)胞表面相應(yīng)的決定簇,發(fā)揮神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用。神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞在各種營(yíng)養(yǎng)因子和周?chē)囟ǖ奈h(huán)境發(fā)揮著修復(fù)脊髓的作用。GDNF可能通過(guò)自分泌或旁分泌方式發(fā)揮作用,因?yàn)樽苑置诨蚺苑置谠趽p傷和應(yīng)激狀態(tài)下更具作用,為急性期脊髓損傷提供新的方法。

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