馬齒莧中總黃酮的提取工藝研究

張?zhí)亓?于春月

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬五院藥劑科,黑龍江 大慶 163316;2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)藥學(xué)院,黑龍江 大慶 163319)

馬齒莧為馬齒莧科一年生肉質(zhì)草本植物馬齒莧 Portulaca oleracea L.的干燥全草。別名半支蓮、松葉牡丹、太陽花、長命菜等 ,具有清解毒、散血消腫、抗菌之作用[1],主治腸炎、菌痢、癰腫、惡瘡、丹毒、蛇蟲咬傷、痔瘡腫毒、濕疹、急性和亞急性皮炎等多種疾病。馬齒莧中的主要成分為黃酮類物質(zhì),本文以總黃酮提取率為指標(biāo),采用正交試驗法分別考察回流提取法及超聲提取法中的各影響因素,并通過對比產(chǎn)生最佳提取工藝,該方法科學(xué)、可行,為馬齒莧的進一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

1 儀器與試劑

UV-7504PC紫外-可見光分光光度計(上海欣茂儀器有限公司);756MC型紫外-可見分光光度計(上海棱光技術(shù)有限公司);SHZ-DIII予華循環(huán)水真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);ESJ200-4電子天平(沈陽龍騰電子有限公司);KH3200DE型數(shù)控超聲波提取器(昆山禾創(chuàng)超聲器有限公司)。

槲皮素對照品購自中國藥品生物制品檢定所(100081-201007)。馬齒莧購自吉林大藥房,由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)藥學(xué)院魏東華教授鑒定,洗凈后放入烘箱干燥后粉成粗粉備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備

精密稱取槲皮素對照品0.0202g,放入100mL容量瓶中,加入50%乙醇適量,置水浴上微熱使溶解,放冷,加50%乙醇至刻度。

2.1.2 供試品溶液的制備

精密稱取馬齒莧藥材粉末1.0010g,加入50%乙醇30mL,在溫度40℃下,超聲提取30min,提取兩次并將兩次濾液合并轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中,用50%乙醇定容。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確量取槲皮素對照品溶液各0.0,0.5,1.0,2.0,3.0,4.0mL置于10mL容量瓶中,用50%乙醇稀釋至刻度,搖勻,以空白溶液為參比,于375nm處測定吸光度。以濃度(C)為橫坐標(biāo),吸光度(A)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程為 A=37.542C+0.0279(R2=0.9997)(n=5)。結(jié)果表明:槲皮素在0.02～0.08mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4 精密度試驗

取對照品溶液 ,采用直接掃描法,于 375nm處連續(xù)測定6次吸光度,計算 RSD=0.2%,表明儀器精密度良好。

2.1.5 重復(fù)性試驗

按照供試品溶液的制備方法平行制備6份溶液,分別測定吸光度。計算 RSD=2.2%,表明方法的重現(xiàn)性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液 ,分別于 0min、 20min、40min、1h、 1.5h、2h、3h、4h、5h、6h測定吸光度并計算 RSD,結(jié)果樣品在3h內(nèi)RSD＜2%,表明樣品3h內(nèi)穩(wěn)定,應(yīng)在該時間內(nèi)盡快測量。

2.1.7 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的馬齒莧藥材5份,分別精密加入槲皮素對照品適量,各份均按樣品溶液的制備方法提取,在375nm處測定吸光度,計算得到平均回收率為102.9%,RSD=2.3%。

2.2 正交試驗設(shè)計

2.2.1 試驗設(shè)計

采用 L9(34)正交試驗設(shè)計法,對回流提取法及超聲提取法中各影響因素進行了考察 ,因素水平見表1及表2。

表1 回流提取法正交試驗因素水平

表2 超聲提取法正交試驗因素水平

2.2.2 試驗結(jié)果

取馬齒莧粉末約1g,按照表3及表4中條件分別進行試驗,并以總黃酮提取率為評價指標(biāo),選取最佳提取工藝。結(jié)果見表 3和表 4。

從表3及表4可以看出,回流提取法中各因素影響次序為提取時間＞提取次數(shù)＞乙醇濃度＞料液比,最佳工藝為A2B3C1D1;超聲提取法中各因素影響次序為提取次數(shù)＞料液比＞乙醇濃度＞提取時間,最佳工藝為 A3B2C2D1。通過對比發(fā)現(xiàn)回流提取法總黃酮提取率普遍偏高,故確定最佳提取條件為:乙醇濃度95%,料液比1:40(g:mL),提取時間1h,提取次數(shù)1次,在該條件下得到總黃酮的提取率為0.76%。

表3 回流提取法正交試驗設(shè)計及結(jié)果

表4 超聲提取法正交試驗設(shè)計及結(jié)果

3 討論

3.1 含量測定方法的選擇

通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)[2～4],總黃酮的含量測定方法多為紫外分光光度法,根據(jù)原理不同又分為亞硝酸鈉顯色法、硝酸鋁顯色法和直接掃描法等,要根據(jù)樣品的實際情況進行選擇。前期工作已證實直接掃描法用于測量馬齒莧中的總黃酮最為合適,樣品和標(biāo)準(zhǔn)品吸收度高,且在同波長處有最大吸收,故本實驗選用此法。

3.2 對照品的選擇

馬齒莧中含有槲皮素、蘆丁、山奈酚、金絲桃苷等黃酮類化合物。前期工作證實蘆丁和槲皮素對照品在375nm左右處都有最大吸收,但槲皮素對照品比蘆丁的更為明顯,故選擇槲皮素作為對照品。

本文前期通過單因素實驗,分別確定了回流提取法和超聲提取法中各因素的水平范圍,后分別對兩種方法進行正交試驗,確立了最佳提取工藝后再進行對比,大大增加了試驗結(jié)果的科學(xué)性和可信性,所得結(jié)論為馬齒莧的進一步研究開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。

[1]洪海.馬齒莧藥理作用及臨床應(yīng)用的研究進展 [J].中外健康文摘,2010,7(27):104-105

[2]李春紅,田吉,何兵,等.紫外分光光度法測定黃芪總黃酮的含量[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2011,36(8):954-956

[3]鄭媛媛,李辰,封士蘭,等.油橄欖葉中總黃酮含量測定方法探討[J].光譜學(xué)與光譜析,2011,31(2):548-550

[4]黃春紅,殷武平,郝小花.野生馬齒莧草粉總黃酮的提取及含量測定 [J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,50(7):1463-1464