人參總甙對 H2O2誘導的大鼠白內障的抑制作用相關實驗研究

楊 寧,王 麗

(佳木斯大學附屬第一醫院眼科,黑龍江 佳木斯 154003)

老化、外傷、遺傳、代謝異常、輻射、中毒和局部營養不良等因素是引起晶狀體囊膜損傷的罪魁禍首,使其滲透性增加,從而失去屏障作用,或導致晶狀體代謝紊亂,使晶狀體蛋白發生變性,形成混濁逐步發展成為白內障。自由基引起的晶狀體氧化損傷及生化改變是對晶狀體產生損傷的主要機制。目前報道有抗氧化作用的中藥有人參、三七、黃芪、靈子等。國內研究顯示人參的乙酸乙酯及水提取物抗氧化活性較高,研究顯示抗氧化活性為中等及中等極性化合物。人參總皂甙是從五加科植物人參的根、莖葉中提取精制而成。體外實驗顯示人參皂甙可以明顯抑制腦和肝中過氧化脂質形成,減少大腦皮層和肝中脂褐素的含量,同時也能增加超氧化物歧化酶和過氧化氫酶在血液中的含量,具有抗氧化作用。本實驗主要探討人參總皂甙對過氧化氫誘導的大鼠白內障的預防作用,為以后預防白內障新藥的系列開發奠定一定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:清潔級 SD大鼠15只,雌雄各半,體重(18±2)g,購于哈爾濱中醫藥大學動物實驗中心。大鼠飼養于隔離籠內(頂部有空氣過濾膜),飲用水和飼料均經高壓滅菌處理,寄養于佳木斯大學動物中心清潔級動物房內。

1.1.2 試劑與儀器

試劑鹽酸川芎嗪注射液廣州南國制藥廠;30%H2O2溶液南昌市東湖青山試劑助劑廠;復方托吡卡胺滴眼液參天制藥株式會社;人參總甙廣東省惠州市東方科技有限公司;超凈工作臺蘇州安泰空氣技術有限公司;眼科顯微手術器械蘇州器械六廠;二氧化碳細胞培養箱丹東市醫療器械廠。

1.2 實驗方法及步驟

1.2.1 大鼠的分組,模型準備、用藥情況

準備健康大鼠共18只,可提高晶狀體36個。首先使用復方托吡卡胺滴眼液散瞳,瞳孔散大后置于裂隙燈顯微鏡下觀察晶狀體是否混濁,需取透明晶狀體進行實驗。將大鼠處死,摘除眼球,將眼球放入 75%酒精浸泡消毒,后放入含慶大霉素 320000U/L的滅菌 PBS中15min。在無菌工作臺上,使用解剖顯微鏡從球后視乳頭處剖開眼球,除去除晶狀體的所有組織,剝離肌肉及韌帶,用撈勺將晶狀體取出放入盛有30mL RPMI-1640培養液的培養皿中。每培養皿放 3個晶狀體,于36.8℃、5.0%二氧化碳、設定培養箱濕度為95%,預孵4h,因人為操作不當造成6個晶狀體混濁已被去除。

1.2.2 實驗分組情況與晶狀體培養程度

參照王勇報道的實驗方法(經過改進:將 Medium199培養液換為 RPM I-1640細胞培養基)將晶狀體用取出,并未經過排列放入不同條件培養液中。1,2,3每組7個晶狀體,4,5每組放入 6個晶狀體,分組如下 (其中 H2O2組是模型組):空白對照組:RPM I-1640培養液30mL,含有青霉素注射液100U/mL、鏈霉素注射液 100U/mL H2O2組:對照組培養液除外,另外加入 30% 過氧化氫 1.0μL(H2O2終濃度為300.0 μmol/L),川芎嗪組:除 H2O2組各成分之外,另加鹽酸川芎嗪30mL。

1.2.3 觀察晶狀體的混濁的程度及分級

在培養完成之后對晶狀體逐一進行拍照。在淺色背景下安排一組寬度為0.5mL,距離2.5mL的深色線條呈交叉垂直狀態,培養完成后將各組大鼠晶狀體放入“+”字交叉的深色線條上面,通過觀察透過晶狀體顯示出的線條清晰度,用這種方法進行分級。比較每個實驗組間 /內的晶狀體混濁的程度不同。

“-”:線條可見并清晰,為透明不混濁晶狀體;計 0分;“+ ”混濁:線條模糊不清 ,但是輪廓大致可見;計 1.0分;“++”混濁:線條輪廓極不清楚,僅中央部分略微可以觀察到;計 2.0分;“+++”混濁:線條完全不見,晶狀體呈全部混濁,計 3.0分。

1.2.4 測定超氧化物歧化酶(SOD)

實驗測定原理:通過黃嘌呤氧化酶及黃嘌呤二者反應產生超氧陰離子自由基,硝酸鹽由前者氧化羥胺形成,在顯色劑的條件下顯現為紫紅色。當測試樣品中含有 SOD時,則對超氧陰離子自由基有唯一性的抑制功能,使亞硝酸鹽形成逐漸減少,利用計算公式可計算出被測樣品中的 SOD活力。用比色法測定 SOD活性,將測定管和對照管分別裝入試劑一1.0mL和試劑二、試劑三、試劑四各 0.1mL,測定管加入樣品0.1mL,對照管加入蒸餾水 0.1mL。用旋渦混勻器充分混勻,置37℃恒溫水浴40min后對照管測定管各加入顯色劑2mL,將各管混勻 ,室溫放置 10min,于波長 550nm處,1cm光徑比色杯,蒸餾水調零,比色測各管 OD值。

計算公式為:組織勻漿中 SOD活力(U/mgprot)=

1.3 統計學處理

采用 SPSS18.0軟件以 P ＜0.05顯示具有顯著差異。

2 結果

在晶體抗氧化酶活方面人參總甙組高于空白對照組,而低于陽性對照組,具有顯著差異 (P ＜0.05),見表1。

表1 培養24h后各組晶狀體抗氧化酶活性 (±s,n=6)

表1 培養24h后各組晶狀體抗氧化酶活性 (±s,n=6)

組 別 SOD活性空白組 38.12±1.86過氧化氫組 9.24±0.58人參總甙組 23.15±1.46

3 討論

人參總甙對鼠白內障的發生、發展有一定的預防作用,應進一步深入研究。中醫藥創新研究是我國最具原始創新潛力的領域,近年來我國中藥產業持續發展,已初步形成了一定規模的產業體系,成為我國國民經濟極具發展優勢和市場前景的戰略性產業。人參素有“百草藥”的美譽,在中醫藥領域已有兩千對年的應用歷史。目前在人參的創新研究過程中,關于人參抗氧化方面的研究有諸多報道。國內周才瓊等[2]人的研究顯示人參的乙酸乙酯及水提取物抗氧化活性較高,研究顯示抗氧化活性為中等及中等極性化合物。例如有學者報道[3]人參可以抑制 SO2引發的肝臟的超氧化物歧化酶、過氧化物酶及過氧化氫酶下降和丙二醛的升高,對 SO2引發的肝臟損傷有一定的防護作用。馬中春[4]等人的研究顯示人參膠囊具有降低雄性老年大鼠血清中過氧化脂質 MDA含量、升高血清中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)的作用,提示人參膠囊在抗氧化領域用很好的應用前景。張嘉麟[5]等人的研究顯示小鼠紅細胞中超氧化物歧化酶(SOD)的活力可以被人參總皂甙可以提高,說明人參總皂甙具有很強的抗氧化活性,在抗衰老方面有一定的應用價值。

[1]劉宏偉,劉遠光.高溫氧化條件下人晶狀體上皮細胞內HSP70mRN A的表達 [J].黑龍江醫藥科學,2008,31(4):19

[2]ZHOU Cai-qiong,ZHANG Bao-yong.Study on anti-oxidation of Indian ginseng in vitro[J].Science and Technology of Food Industry,2008,02:4-8

[3]Ai Y,Zheng Z,O'Brien- Jenkins A,et al.A mouse model of galactose-induced cataracts[J].Hum Mol Genet,2000,22(12):1821-1827

[4]馬中春.人參膠囊降低雄性老年大鼠血清中過氧化脂質 M DA含量、升高血清中谷胱甘肽過氧化物酶研究進展 [J].眼科新進展,2003,23(1):52-55

[5]張嘉麟.三七中人參皂甙對老年鼠血液中抗氧化酶活力影響的研究 [J].昆明醫學院學報,2005,25(4):308-309