黑龍江人群 CYP2C19*2基因型泮托拉唑藥動學關系研究

國玉芝,孟婷婷,黃 展,雷力力

(佳木斯大學附屬第一醫院,黑龍江 佳木斯 154003)

洋托拉唑(pantoprazole,PAN),是奧美拉唑、蘭索拉唑上市后的第三代質子泵抑制劑(proton pump inhibitors,PPIs),臨床上廣泛用于治療各種酸相關性疾病,如消化性潰瘍,胃食管反流性疾病等。其主要由 P450 CYP2C19代謝,由于編碼該酶的基因突變,使人群分為強代謝(extensive metabolizers,EM)、中代謝 (intermediate metabolizers,IM)與弱代謝(poor metabolizer,PM)三種基因型,藥物的藥理作用在不同基因型之間的藥理作用不同[1～3],即不同基因型患者服用相同劑量的藥物會產生不同的治療效果,所以不同基因型的患者應該差別用藥,以達到經濟有效的目的。但是,國內對于人群中不同 CYP2C19基因型對于泮托拉唑代謝的影響研究報道較少,尤其是不同地區及生活習性的不同可能基因型分布也會有一些差異,黑龍江地處高寒地區,人群使用腌菜及食鹽較多,基因型分布及對泮托拉唑代謝的影響會否不同,尚未見報道,由于在 CYP2C19基因變異種 CYP2C19*2位點變異較多,研究意義較大,因而我們對其基因型分布及對泮托拉唑藥動學的影響進行研究,以為提高用藥的針對性,提高藥物療效,減少不良反應,保證用藥安全提供基礎資料。

1 儀器及試劑

大連依利特 P230Ⅱ高效液相色譜儀,Waters2475多波長熒光檢測器,EC2006色譜數據處理工作站。BIO-RAD S1000Thermal CyclerPCR儀,BIO- RAD PowerPac Universal通用電泳儀,BIO-RAD ChemiDoc XRS凝膠成像系統,安徽中科中佳 HC-2518R高速離心機。

色譜純乙腈:天津凱通化學試劑有限公司生產;泮托拉唑、蘭索拉唑購自中國藥品生物制品檢定所。Genomic DN A Purification kit,Star pcr Taq,50bp DNA Marker,HphⅠ ,以上試劑為 Fermentas公司生產。CYP2C19* 2擴增引物由生工生物工程(上海)有限公司合成,DN A測序由生工生物工程(上海)有限公司北京測序部完成。

2 方法

2.1 實驗設計及受試者選擇

2.1.1 受試者選擇:在健康體檢人員中隨機選擇100名經心電圖、胸透、血尿常規、肝腎功能均正常人員入選進行CYP2C19*2基因檢測,從中挑選快(AA基因型)、中(GA基因型)、慢(GG基因型)代謝人員各8名進行藥動學實驗 ,試驗前遵循赫爾辛基宣言,經醫學院倫理委員會批準,受試者在被告知所有可能出現的不良反應后,簽署知情同意書。

2.1.2 實驗方案:健康志愿者從試驗前2周開始及試驗期間不得服任何藥物,禁用含酒精、咖啡因飲料。于服藥前日晚8:00起禁食,于次日晨 8:00口服泮托拉唑腸溶膠囊40mg,溫開水 200mL送服。服藥后4h統一進標準餐。受試者在給藥前及給藥后1,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5,6,7,9,12h各抽取肘靜脈血4.0mL。血樣經檸檬酸鈉抗凝,靜置10min后,3500rpm離心10min,收集上層血漿,-20℃保存待測。所有樣品在取樣后10d內測定完畢。

2.2 基因檢測

PCR引物:上游引物 5’一 CAG AGC T TG GCA TAT TGT ATC-3',下游引物 5’一 GTA AAC ACA CAA CTA GTC AAT G-3'。PCR:Hot Star酶12.5μL,F、R引物各1μL,提取 DN A2 μL,ddH2O 9.5 μL。95℃預變性 4min,95℃變性 30s,56℃退火 30s,72℃延伸 30s,72℃末延伸 5min,35個循環。酶切及電泳:10×green buffer2μL,PCR產物 15μL,SmaⅠ 2μL,ddH2O10μL;水浴 37℃酶切 5min,然后取出置水浴65℃滅火 5min。使用 2.0%瓊脂糖凝膠,電壓 145V,電泳40min。

2.3 血藥濃度檢測方法

血漿中泮托拉唑采用高效液相色譜法測定,取血漿0.5mL,加內標蘭索拉唑 (含蘭索拉唑 0.0332mg˙mL-1)25μL,0.1molμL-1氫氧化鈉溶液 50μL,漩渦混勻 ,加無水乙醚-乙酸乙酯混合液 (3:2)3mL,漩渦提取,3000r˙min-1離心5min,分取有機層,38℃水浴氮氣流下吹干,殘渣加甲醇0.1mL漩 渦溶解 ,3000r˙min-1離心 5min,進樣 40 μL。色譜柱:Hpersil ODS2C18(4.6mm× 150mm,5μm);流 動 相:0.01mol μL-1磷酸氫二鉀溶液 (磷酸調 pH7.0)-乙腈 (72:28);流速:1.4mL˙min-1;檢測波長:288nm;柱溫:35℃。以泮托拉唑樣品峰面積與內標峰面積比值(X)對其加入濃度(Y)作線性回歸,得回歸方程為:y=0.7897x+ 0.0939,R2=0.9978,線性范圍為:0.019μ g˙mL-1～12.672μ g˙mL-1,定量下限為:0.019 μg˙mL-1。

2.4 統計學處理

PAN的藥時曲線用3P97程序作參數估算。Cmax和 Tmax用實測值。采用梯形法計算曲線下面積(AUC),計量資料兩組比較時采用 t檢驗。

3 結果

3.1 基因型分析

PCR產物為321bp,681位堿基為 G時 ,PCR產物能被Sma I酶切 ,酶切后產生212bp,109bp2個片段,681位堿基為A則不能被 Sma I酶切 ,只有 1個 321bp的片段。因此可區分為三種不同的基因型:GG型酶切后產生212bp,109bp 2個片段,GA型酶切后產生321bp,212bp,109bp三個片段,AA型不能被酶切,只有321bp一個片段。

在本試驗條件下,三種不同基因型能夠清晰分離,見圖1;經毛細管電泳測序,與本實驗結果一致,見圖 2。

圖1 CYP2C19*2電泳圖譜

圖2 CYP2C19*2測序圖譜

3.2 泮托拉唑藥動學

在本實驗條件下,泮托拉唑與內標蘭索拉唑分離良好,血漿內源性成分不影響檢測 ,泮托拉唑低中高0.095、0.792、6.336 μg˙mL-1三種濃度準確度在 99.00% ～102.00%,日內及日間 RSD在 3.00%～14.00%,血漿樣品-20℃保存20d內穩定。

按基因型分組口服40mg泮托拉唑后的藥-時曲線見圖3,經3P97軟件處理后,各項數據如表1。

圖3 口服泮托拉唑后的藥-時曲線

表1 三種基因型單劑量口服泮托拉唑后主要藥動學參數 (±s,n=8)

表1 三種基因型單劑量口服泮托拉唑后主要藥動學參數 (±s,n=8)

GG與 GA型、△GA與 AA之間有顯著性 P＜0.05;# GG與 AA之間有高度顯著性 P＜0.01。

基因型 Ke/h-1 Ka/h-1 t1/2/h Tmax/h Cmax/mg˙L-1 AUC/mg˙h-1 CL/F/L˙h-1 Vd/F/L GG 0.34± 0.06*# 0.82± 0.75 2.11± 0.32*# 2.92± 0.53 2.2± 0.49*# 7.15± 2.27*# 6.21± 2.28*# 18.84± 7.39*#GA 0.45± 0.08 0.89± 0.15 1.59± 0.39△ 3.12± 0.23 3.41± 0.65△ 12.63± 4.24△ 3.46± 1.03△ 7.55± 1.29 AA 0.19± 0.06 0.68± 0.33 3.73± 0.99 3.56± 0.62 4.67± 1.13 33.43± 14.13 1.41± 0.61 6.92± 1.64*

三組泮托拉唑受試者口服后的藥時曲線經3P97軟件分析,符合一房室模型,由表 1可見,藥動學參數 t1/2、Cmax、AUC、CL/F在三組之間,Ke、Vd/F在 GG與 GA、AA之間,Tmax在 GG型與 AA型二組之間差異有顯著性 (P ＜0.05)。藥動學參數 Ke、 t1/2、 Cmax、 AUC、CL/F、Vd/F在 GG與 AA基因型之間有高度顯著性 (P＜0.01)。

4 討論

藥物反應個體間差異廣泛存在,藥物代謝酶基因、轉運體基因、受體基因、靶體基因以及表觀遺傳的多態性與藥物代謝、藥物效應及毒性的個體間差異密切相關[4]。個體化給藥要求綜合考慮個體的基因與環境因素,全面預測個體患病風險以及對藥物的反應效果,選擇最佳處方,優化疾病治療[5]。根據不同個體的基因多態性來選擇藥物和給藥方案,將為個體化合理用藥提供強有力的科學依據。

本試驗研究泮托拉唑藥動學與 CYP2C19*2基因型的關系。所有受試者按方案完成全部試驗,未有中途退出,未出現任何不良反應。

由試驗結果看出,不同 CYP2C19*2基因型對個體泮托拉唑血藥濃度影響明顯 (圖1)。從給藥后1.0h起,GG基因型與 AA型組間泮托拉唑的血藥濃度存在明顯差異,表明CYP2C19*2與泮托拉唑代謝密切相關。

本研究中 CYP2C19*2AA與 GG基因型的 t1/2,Cmax及AUC比較,分別為1.77、2.12和4.68倍表明不同基因型對血藥濃度影響較大,本研究結果與文獻[6,1]報道結果基本一致。

以上試驗結果表明:CYP2C19*2基因是泮托拉唑藥代動力學的關鍵決定因素,泮托拉唑在突變純合子(AA基因型)個體體內代謝能力明顯降低。這可能是由于 CYP2C19*2等位基因變異使外顯了5第681位的堿基發生 G→ A變異,形成一個異常剪切位點,使得在轉錄時外顯了5的起始端丟失了40個堿基對,從而在核糖體翻譯時丟失了215→ 227位的氨基酸,進而使得215位氨基酸開頭的閱讀框架發生移動,因此在215位氨基酸下游的第 20個氮基酸處提前產生了1個終止密碼子,使得蛋白合成過早被終止,其結果使這一截短的含234個氨基酸的蛋白失去了催化活性[7],因此對底物的代謝能力大幅度下降。

泮托拉唑的含量測定方法很多,我們曾采用文獻[8]報道方法檢測,但其對于體內藥物的檢測在靈敏度與重復性方面差異較大,經過反復試驗,最終采用了本文的方法。

綜上所述,本文在健康受試者中研究了 CYP2C 19*基因多態性對泮托拉唑代謝動力學的影響,我們認為CYP2C19*2基因是泮托拉唑體內動力學過程重要決定因素,是泮托拉唑藥物治療效應與不良反應個體間差異的重要因素。因此,泮托拉唑給藥治療前進行 CYP2C19*2等基因分型,結合血漿藥物濃度監測,可優化個體治療方案,提高臨床療效,降低不良反應。

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