不同鵝品種脂聯素基因第2外顯子多態性分析

王 健， 董 飚， 龔道清

(1.江蘇農牧科技職業學院，江蘇 泰州 225300;2.國家級水禽基因庫，江蘇 泰州 225300;3.揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009)

在動物生產中，動物攝入能量首先用于維持，然后多余的才會被用于生產和轉化為脂肪等形式儲存起來。脂肪組織可以儲存能量，還可參與能量代謝和平衡［1］。禽類的脂肪沉積主要集中在皮下脂肪和腹脂，但這些脂肪并不符合現代消費者的需求。影響禽類的脂肪沉積的因素較多，其中遺傳和營養是最主要的因素。如何降低禽類的脂肪沉積能力，提高經濟效益，降低飼料成本，國內外禽類遺傳育種學者參與了動物脂肪沉積的研究，其中功能基因是研究方向之一。脂聯素是脂肪組織特異性分泌的一種膠原樣細胞因子，人和哺乳動物脂聯素基因包含了3個外顯子和2個內含子［2-3］，禽類脂聯素只有2個外顯子和1個內含子［4］。脂聯素基因最初是在人類上進行了研究，主要認為其與II型糖尿病有顯著性關系，然后才逐漸轉移到哺乳動物、禽類上進行研究。在鴨、鵝方面的研究主要集中在多態位點的檢測、基因克隆、mRNA在不同組織或者時期的表達規律等［5-11］。本文擬尋找出中國部分地方白鵝品種脂聯素基因在外顯子上可能存在的點突變，檢測其在不同鵝品種中分布情況，分析群體遺傳參數，為鵝品種鑒定、保存和選育提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗用太湖鵝、豁眼鵝、四川白鵝、浙東白鵝、皖西白鵝5種白鵝均由國家級水禽基因庫所提供，每個品種60只，公母各半。翅靜脈采取血樣，4%EDTA進行抗凝，采用酚/氯仿法提取基因組DNA，并溶解于水中備用。

1.2 PCR引物的設計

根據鵝脂聯素基因DNA序列(GenBank No:EU370686)設計2對引物，擴增第2外顯子序列。ADP1上游引物序列:5'-ACTCCTGATCCCAACTCTGT-3'、下游引物序列:5'-GTCGTAGTGGTTCTGCTCGT-3'，退火溫度為56℃，擴增長度為245 bp;ADP2上游引物序列:5'-ACGAGCAGAACCACTACGAC-3'、下游引物序列:5'-TGAGATGGAGCAAGACCGAG-3'，退火溫度為55℃，擴增長度為204 bp。

1.3 PCR 擴增

PCR 擴增體系為20.00 μl，包括10 ×PCR buffer(無 Mg2+)2.00 μl、10 mmol/L dNTPs 2.00 μl、25 mmol/L MgCl21.20 μl、10 pmol/L 上下游引物各0.80 μl、5 U/μl Taq 酶 0.12 μl、100 ng/μl DNA 模板 0.80 μl、加 ddH2O 至 25.00 μl。PCR 擴增條件為94℃變性5 min;94℃ 30 s，56/55℃ 30 s，72℃30 s共35個循環;72℃延伸10 min，4℃保溫。PCR產物在1.2%瓊脂糖凝膠中電泳，結束后用凝膠成像系統檢測擴增結果。

1.4 SSCP分型與測序

在5 μl PCR產物中加入5 μl上樣緩沖液進行混合，98℃變性10 min，迅速插入冰中，放置5 min，在12%非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳，銀染顯色、判型。挑選純合基因型個體的PCR產物切膠回收，連接到PMD18-T載體上轉化到大腸桿菌DH5α上，經過鑒定后送上海桑尼生物工程有限公司進行序列測序。

1.5 數據統計分析

運用DNAMAN軟件比對尋找出不同基因型間存在的點突變。根據聚丙烯酰胺凝膠染色圖統計出各個群體基因型數，進而計算出基因型頻率和等位基因頻率，用卡方檢驗分析不同基因型在群體之間差異情況。

2 結果

2.1 PCR 檢測結果

將2對引物分別對部分鵝基因組DNA進行PCR擴增，在1.5%瓊脂糖電泳上檢測，結果顯示擴增片段與目的片段大小一致且特異性好，可以直接進行SSCP分析。

2.2 SSCP 檢測結果

引物ADP1對不同鵝品種進行PCR擴增后進行SSCP檢測，結果顯示引物ADP1擴增的片段上存在多態，主要存在3種基因型，分別命名為XX、XY和YY(圖1)。引物ADP2對不同鵝品種進行PCR擴增后進行SSCP檢測，結果顯示引物ADP2擴增的片段上沒有多態性。

圖1 引物ADP1對部分鵝品種PCR擴增產物SSCP分析Fig.1 SSCP analysis of goose breeds PCR products with primer ADP1

2.3 多態性基因片段的克隆與測序

取XX和YY基因型的PCR產物進行片段回收、克隆和測序。運用生物學軟件DNAMAN分析測序結果，其中YY型與GenBank中上傳的鵝脂聯素基因序列一致;XX型與YY型相比，在外顯子第351處發生了腺嘌呤(A)→尿嘧啶(G)突變(圖2)，該突變未引起氨基酸發生變化。

圖2 不同基因型間核苷酸序列比較Fig.2 Comparison of nucleotide sequence among different genotypes of goose

2.4 不同鵝品種基因型(基因)頻率比較

對不同鵝品種分別進行基因型檢測，計算不同鵝品種的基因型頻率和基因頻率(表1)。太湖鵝以XY基因型較高，YY基因型次之;皖西白鵝、浙東白鵝和四川白鵝均以YY型基因型為主，XY基因型次之，XX基因型比例極小，其中皖西白鵝和浙東白鵝YY型幾乎是XY型的2倍;豁眼鵝以XX和XY基因型為主，YY基因型比例相對較低。豁眼鵝以X等位基因為優勢基因，其他5個鵝品種均以Y等位基因為優勢基因，其中浙東白鵝Y等位基因頻率最高，達0.833 3。

由表2可知，豁眼鵝基因型分布與其他鵝群體存在極顯著差異;浙東白鵝基因型分布與太湖鵝、四川白鵝存在顯著差異;其他鵝品種之間無顯著性差異。

表1 不同鵝品種基因型及等位基因頻率Table 1 The frequencies of genotypes and alleles among different breeds of goose

表2 不同基因型在鵝品種之間的卡方檢驗結果Table 2 The χ2detection of genotypes in different breeds of goose

2.5 遺傳特性分析

群體遺傳分析結果(表3)顯示，浙東白鵝純合度最高，為0.722 2;皖西白鵝次之，為0.670 1;豁眼鵝最低，為0.508 9。除浙東白鵝為低度多態外，其他4個鵝品種為中度多態，其中以豁眼鵝多態信息含量最高，為0.370 5。

表3 不同鵝品種的遺傳參數Table 3 Genetic parameters for different breeds of goose

3 討論

脂聯素基因在禽類群體中均存在，在同一物種或品種，脂聯素基因在序列上絕大部分是相同的，只有少數堿基存在差異，這就是所謂的點突變。這些點突變在內含子中的變化影響作用要小于在外顯子上，外顯子上的點突變可以引起某個氨基酸或者整個氨基酸序列變化，從而影響該序列編碼蛋白質的功能。在外顯子上點突變主要分為同義突變、錯義突變和無義突變。本研究在外顯子2上設計了2對引物，首次在鵝脂聯素基因外顯子上發現了點突變，突變位置為第351處，是腺嘌呤(A)與尿嘧啶(G)之間發生了突變，該突變未引起氨基酸發生變化。與鴨相比，其在外顯子2上的點突變數較少［7］，這說明鵝在進化過程中比較保守。

在太湖鵝、皖西白鵝、豁眼鵝、四川白鵝和浙東白鵝5個中國地方白鵝群中存在3種基因型，分別為XX型、YY型和XY型。太湖鵝、皖西白鵝、四川白鵝和浙東白鵝主要以XY型、YY型2種形式存在，另外，4種鵝Y等位基因頻率均明顯高于X等位基因頻率。豁眼鵝主要以XX型、XY型2種基因型存在，2個等位基因頻率之間的差異相對于其他4個品種來說要小很多。不同等位基因在品種之間分布情況顯示，豁眼鵝與其他4個鵝之間存在顯著性差異，浙東白鵝與太湖鵝、四川白鵝之間存在顯著性差異。豁眼鵝為小型品種，其產蛋率在中國地方品種中最高，主要分布在山東省、遼寧省內;太湖鵝也屬于小型品種，主要分布于江蘇省和浙江省的太湖流域;浙東白鵝為中型品種，主要分布于浙江省東部。皖西白鵝屬于中型品種，主要分布于安徽省西部;四川白鵝屬于中型品種，主要分布于四川省。在品種進化過程中，因自然和人類的影響使得不同品種向不同生產性能方向進化，間接導致不同品種之間脂聯素基因型頻率產生了差異。品種之間的基因型頻率差異為品種選育和進行品種雜交提供了素材。在禽類上已經有了一些關于脂聯素基因點突變與生產性能之間的關聯性分析的報道，劉大林等分析了京海黃雞脂聯素基因第1內含子中的1個點突變與屠體性狀的遺傳效應，提出脂聯素基因可能是調控脂肪性狀的主效基因或與主效基因連鎖［12］。張依裕等在白羽番鴨內含子中發現了C→T突變，發現CC純合子的白羽番鴨肉質更好［13］。

本研究以脂聯素基因中存在的多態位點分析了5個白鵝群體的遺傳參數，以浙東白鵝、皖西白鵝的純合度較高，豁眼鵝純合度最低。結合群體遺傳信息含量，表明豁眼鵝擁有最豐富的遺傳信息，其選擇的遺傳潛力最大，這與品種形成時間最短也有一定的關系，說明其選擇的時間較短;另外，浙東白鵝的遺傳信息含量最低。這些結果與董飚等在研究脂聯素基因內含子遺傳多樣性中的分析結果一致［7］。

［1］AILHAUD G.Adipose tissue as a secretary organ:from adipogenesis to the metabolic syndrome ［J］.Comptes Rendus Biologies，2006，329(8):570-577.

［2］TAKAHASHI M，ARITA Y，YAMAQATA K，et al.Genomic structure and mutations in adipose-specific gene，adiponectin［J］.International Journal of Obesity，2000，24(7):861-868.

［3］DAS K，LIN Y，WIDEN E，et al.Chromosomal localization，expression pattern，and promoter analysis of the mouse gene encoding adipocyte-specific secretory protein Acrp30［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2001，280(4):1120-1129.

［4］YUAN J，LIU W，LIU Z L，et al.cDNA cloning，genomic structure，chromosomal mapping and expression analysis of ADIPOQ(adiponectin)in chicken［J］.Cytogenetic and Genome Research，2006，112(1-2):148-151.

［5］徐國慶，龔道清，董 飚，等.鵝脂聯素基因的克隆、序列分析及組織表達［J］.農業生物技術學報，2008，16(6):941-946.

［6］薛茂云，董 飚，顧志良，等.鴨脂聯素基因全長cDNA的克隆和原核表達的研究［J］.畜牧獸醫學報，2010，41(10):1232-1239.

［7］董 飚，龔道清，孟 和，等.鴨脂聯素基因單核苷酸多態性檢測及群體遺傳分析［J］.遺傳，2007，29(8):995-1000.

［8］楊德全，葛菲菲，劉 健，等.一株鴨源H4N6亞型禽流感病毒A/duck/Shanghai/Y20/2006的全基因組序列測定及遺傳演化分析［J］.江蘇農業學報，2012，28(4):815-822.

［9］鈕慧敏，李 銀，黃欣梅，等.1株鴨病毒性肝炎病毒的分離與鑒定［J］.江蘇農業科學，2011，39(6):374-376.

［10］張響英，唐現文，王利剛，等.實時熒光定量RT－PCR檢測獅頭鵝繁殖周期中PRL mRNA的表達［J］.江蘇農業科學，2012，40(9):50-52.

［11］洪勝輝，張 軍，張 蕊，等.鵝原代肝細胞的簡易、高純分離及培養［J］.江蘇農業科學，2012，40(4):56-58.

［12］劉大林，俞亞波，魏 岳，等.脂聯素基因對京海黃雞體重及屠體性狀的遺傳效應［J］.揚州大學學報:農業與生命科學版，2009，30(1):31-34.

［13］張依裕，徐 琪，段修軍，等.白羽番鴨脂聯素基因內含子多態與肉質的關聯分析［J］.河南農業科學，2010(7):97-103.