OM-APS復方及其組分對新城疫疫苗免疫效果的影響

邢玉娟， 陳玉庫， 胡元亮， 王德云， 陳 茜， 郭振環， 王君敏， 趙曉娜

(1.江蘇畜牧獸醫職業技術學院，江蘇 泰州 225300;2.南京農業大學中獸醫學研究室，江蘇 南京 210095)

研究證明，中藥作為一種免疫增強劑，具有來源廣泛、效果顯著、無毒副作用等優勢，不僅能克服油乳類、鋁膠類化學佐劑副作用大、局部刺激重、致癌、制備和使用麻煩或不能足夠提高弱抗原的免疫原性等弊病［1-2］，而且能顯著增強機體的細胞免疫和體液免疫功能，促進免疫器官的發育和細胞因子的分泌［3-4］。

在以前的研究中，筆者首先通過體外試驗篩選出氧化苦參堿(OM)、黃芪多糖(APS)等具有顯著抑制新城疫病毒(NDV)增殖作用的中藥成分，然后比較了中藥成分復方體外抗NDV感染的效果，結果表明中藥成分復方無論是高濃度，還是中、低濃度都能顯著抑制NDV感染雞胚成纖維細胞(CEF)［5］。通過臨床試驗比較了中藥成分復方對雛雞人工感染新城疫的療效，結果表明，在攻毒前、與攻毒同時和攻毒后給藥，中藥成分復方均能顯著降低受試雞的死亡率，提高血清NDV抗體效價，減輕死亡雞的器官出血［6］。

本試驗在測定了OM、APS、甘草酸(GA)、桅子苷(GP)等4種中藥成分體外對雞脾臟淋巴細胞增殖的影響，篩選出具有較好增強免疫效果的OM和APS基礎上，擬使用OM和APS的中藥成分復方OM-APS(OAP)及其組分藥配合新城疫疫苗免疫，測定雛雞免疫后外周血T淋巴細胞增殖、血清抗體效價和細胞因子的變化，旨在闡明中藥成分復方免疫增強的作用機理，為研制中藥成分免疫增強劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 藥物準備

根據以前的試驗結果［5-6］，分別用雙蒸水將OM、APS 和 OM-APS(OAP)稀釋成 4 mg/ml、2 mg/ml、1 mg/ml，分別代表高、中、低 3 種濃度，常規消毒后備用。

1.2 疫苗和病毒

新城疫Ⅳ系(Newcastle Disease virusⅣ strain，NDV-Ⅳ)疫苗，中牧股份南京藥械廠生產，批號753-3。新城疫檢測抗原，由南京農業大學動物醫學院中獸醫研究室提供。

1.3 主要試劑

RPMI1640培養液，Gibco公司產品，按說明書用三蒸水配制后過濾除菌，分裝，4℃保存，臨用前加入犢牛血清達5%和青霉素、鏈霉素各100 IU/ml;植物血凝素(PHA)，上海伊華科技有限公司產品，用 RPMI1640培養液配制成 0.1 mg/ml，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，分裝后－20℃保存;四甲基偶氮唑藍(MTT)溶液，Amresco公司產品，用pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解，使終濃度為5 mg/ml，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，分裝后4℃冰箱避光保存;淋巴細胞分離液，上海恒信化學試劑有限公司產品;淋巴細胞裂解液，二甲基亞砜(DMSO)，分析純，蘇州正興化工研究院產品。

1.4 試驗動物

1日齡非免疫健康羅曼蛋公雞700羽，購自南京湯泉農墾種雞場。試驗期間采用籠養，全價飼料，自由采食和飲水，1～14日齡采用紅外燈保溫，全日制光照。

1.5 試驗設計

雛雞飼養至14日齡去除病弱雞，選取660羽［平均體重95 g，平均母源抗體效價(2.4±0.5)lg2］，隨機均分為11組。第1～9組為OAP高劑量組(OAPH)、OAP中劑量組(OAPM)、OAP低劑量組(OAPL)、OM高劑量組(OMH)、OM中劑量組(OMM)、OM 低劑量組(OML)、APS高劑量組(APSH)、APS中劑量組(APSM)和 APS低劑量組(APSL)，第10組為疫苗對照組，第11組為空白對照組。除空白對照組外均用NDV-Ⅳ系疫苗滴鼻、點眼免疫，每羽1份。28日齡二免。在首次免疫的同時，3個中藥復方組分別口服高、中、低劑量的OAP、OM和APS，免疫對照組和空白對照組口服等量生理鹽水，每天1次，連續3 d。在首次免疫同時，分別于14、21、28、35、42 日齡采血，抗凝血 MTT 法測定外周血淋巴細胞增殖，非抗凝血血清用β-微量法測定HI抗體效價。于14、28、42日齡，采血分離血清，用ELISA方法檢測IL-2和IFN-γ的含量。

1.6 淋巴細胞增殖測定方法

采用MTT法［3-4］測定淋巴細胞增殖情況。將抗凝血樣(每羽2 ml)用Hank’s液稀釋1倍，小心加在淋巴細胞分離液上層，2 000 r/min離心20 min，吸取中間云霧狀白細胞層，用無血清RPMI1640營養液洗2遍，每分鐘1 500 r/min離心15 min。臺盼藍染色，細胞計數，活細胞大于90%后，用RPMI1640營養液調整細胞濃度為1 ml 2.5×106個，加入到96孔細胞培養板(德國Nunclon公司生產)中，每孔80 μl，再加20 μl PHA，每個樣品重復 4 孔，然后置于39.5℃、5%CO2條件下(CO2培養箱，美國 Revco 公司產品)培養44 h，每孔加入 MTT溶液20 μl，繼續培養4 h后，每孔加裂解液100 μl，將細胞板置于微量振蕩器(75-2A型，上海醫用分析儀器廠生產)上振蕩5 min使沉淀完全溶解，在酶聯免疫儀(DG-3022型，中國華東電子管廠生產)上檢測570 nm處的吸光值(A570)作為T淋巴細胞增殖的指標。

1.7 抗體效價測定方法

在96孔微量血凝板上，從左到右每孔各加50 μl PBS液，再向每排的第1孔加入50 μl待檢血清，依次向后倍比稀釋直至第12孔，然后向每孔加入50 μl 4個單位的抗原，在微量振蕩器上振蕩混勻后置于溫箱中感作20 min。取出向每孔加入50 μl雞紅細胞懸液，同時設陽性血清、陰性血清及空白對照孔。振蕩混勻后置于37℃溫箱中感作30 min，待對照孔紅細胞已經沉淀時觀察結果［7］。

1.8 IL-2 和 IFN-γ 的測定

分離血清后按照試劑盒說明書測定IL-2和IFN-γ的含量。

1.9 數據處理

數據采用平均數±標準差表示，用SPSS軟件12.0統計分析，比較各組間的差異性。

2 結果

2.1 淋巴細胞增殖的變化

從表1可以看出，免疫組各時間點A570值均顯著高于空白對照組(P＜0.05)。OAPH、OAPM、OMH、OMM、APSH、APSM在雛雞各日齡段，OAPL和APSL在 21、28、35 和 42 日齡，OML在 21、28 和 42日齡的A570值顯著高于免疫對照組;OAPH在雛雞各日齡段，A570值均顯著高于 OMH和 APSH(P＜0.05);OAPM在28日齡 A570值高于 APSM，但差異不顯著，其余日齡段 A570值均顯著高于 OMM和APSM(P ＜0.05);復方組(OAPH、OAPM、OAPL)和OMH、APSH在21日齡A570值達到高峰，其余各單味藥對照組在28日齡達到高峰。

表1 淋巴細胞的增殖Table 1 Proliferations of T lymphocytes

2.2 抗體效價的變化

從表2可以看出，所有處理抗體效價均顯著高于空白對照組(P＜0.05);OAPH、OAPM在雛雞14日齡，OMH、OMM在 21 日齡，OAPH、OAPM、OAPL、OMM和 APSM在 28 日齡，OAPH、OAPM、OAPL、OMM、APSH、APSM在 35 日齡，OAPH、OAPM、APSM在 42 日齡抗體效價顯著高于免疫對照組;OAPH的抗體效價在各時間點均顯著高于OMH和APSH(P＜0.05);OAPM抗體效價在21、28、35、42 日齡顯著高于OMM，21、28和35日齡顯著高于APSM(P＜0.05);OAPL抗體效價在28日齡顯著高于OML(P＜0.05)。

表2 血清抗體效價的變化(lg2)Table 2 Changes of the serum antibody titers(lg2)

2.3 血清中IL-2水平的變化

從表3可以看出，所有免疫組血清IL-2濃度均顯著高于空白對照組(P＜0.05);OAPH、OAPM、OAPL、OMH、OMM、APSH、APSM在各日齡段、OML在42日齡、APSL在14和42日齡血清IL-2濃度均顯著高于免疫對照組(P＜0.05);OAPH在各日齡段血清IL-2濃度均顯著高于OMH和APSH，OAPM在各日齡段血清IL-2濃度均顯著高于OMM和APSM，OAPL在28、42日齡血清 IL-2濃度顯著高于 OML和 APSL(P＜0.05)。APSL和空白對照組血清中IL-2濃度在14日齡達到高峰，然后下降，其余各組均在28日齡達到峰值。

表3 血清中IL-2濃度的變化Table 3 Changes of IL-2 concentrations in serum

2.4 血清中IFN-γ 水平的變化

從表4可以看出，口服中藥的9個處理在雛雞各日齡段血清IFN-γ濃度均顯著高于空白對照組(P＜0.05);OAPH、OAPM在雛雞各日齡段血清IFN-γ濃度均顯著高于免疫對照組(P＜0.05)。APSH、APSM在28和42日齡，OAPL在42日齡，OMM在42日齡血清IFN-γ濃度均顯著高于免疫對照組(P＜0.05)。OAPH在雛雞各日齡段血清IFN-γ濃度均顯著高于OMH和APSH，OAPM在28、42日齡血清IFN-γ濃度顯著高于 OMM和 APSM(P＜0.05)。OAPL、OMH、OMM、OML、APSL和免疫對照組血清中 IFN-γ濃度在14日齡達到高峰，然后下降，其余各組均在28日齡達到峰值。

表4 血清中IFN-γ濃度的變化Table 4 Changes of IFN-γ concentrations in serum

3 討論

3.1 中藥成分復方及其組分藥對細胞免疫和體液免疫的影響

淋巴細胞增殖是反映機體細胞免疫水平的一個重要指標［7］。細胞免疫可以通過致敏淋巴細胞與相應抗原作用而發揮抗病原體感染、抗腫瘤、幫助B淋巴細胞產生抗體等作用。唐雪明和孔祥峰等也通過體內外試驗證實黃芪多糖及其復方具有提高雞淋巴細胞增殖的作用，并且具有一定的劑量效應［8-9］。本試驗結果表明，與免疫對照組比較，OAP、OM、APS均具有增強淋巴細胞增殖的作用，高劑量的效果優于低劑量。

血清抗體效價反映機體體液免疫狀態，體液免疫是機體抗御感染的主要因素之一，通過抗原-抗體結合反應而起到抗菌、抗病毒、抗外毒素等多種作用［10］。王德云等亦研究報道黃芪多糖及其復方等具有提高機體特異性抗體的效果，高劑量促進抗體生成的作用強于低劑量［7］。本試驗結果表明，與免疫對照組比較，OAP、OM、APS均具有提高新城疫特異性抗體的作用，增強機體體液免疫的效果，且高劑量效果優于低劑量。

3.2 中藥成分復方及其組分藥對細胞因子分泌的影響

細胞因子是一類主要由免疫細胞產生的極微量的具有廣譜生物學活性的小分子肽，是免疫系統重要調節因子，病原感染或疫苗接種產生的細胞因子決定免疫反應的類型和程度。IL-2是一種具有廣泛生物學活性的細胞因子，可以輔助CTL細胞表達殺傷功能，IFN-γ是由T淋巴細胞不同的亞群分泌的免疫調節因子，具有廣泛抗病毒、抗腫瘤和雙向免疫調節作用，同時對不同免疫細胞間相互作用和發揮免疫功能具有重要的介導作用［11］。

本試驗結果表明，OAP、OM、APS均具有促進細胞因子分泌，提高血清中IL-2和IFN-γ濃度的作用。并且在選用的劑量中，高劑量和中劑量組在雛雞多個日齡段提高血清中2種細胞因子濃度的作用強于低劑量。馬霞、王德云、陳玉庫等也通過試驗證明，黃芪多糖、氧化苦參堿和黃酮等中藥成分及其復方體內外均具有促進IL-2、IL-6和IFN-γ等細胞因子分泌，攻毒保護試驗也表明細胞因子高劑量用藥組保護率也相應高于低劑量用藥組［12-14］。

3.3 復方增強免疫作用與單味組分藥的比較

本試驗結果表明，OAP是由OM和APS組成的復方，在促進淋巴細胞增殖、提高特異性抗體生成、增加細胞因子分泌等增強免疫作用方面，同等劑量復方多優于單味組分藥，表明兩種組分藥有協同作用。王德云等研究當歸多糖、黃芪多糖及其復方等對培養的雞脾臟淋巴細胞增殖、抗體生成、細胞因子分泌的影響，也得到相似結果［7，13］。范云鵬等研究中藥成分黃酮及其復方增強免疫作用時，也發現復方的作用效果優于單味成分［15］。研究只報道了中藥或中藥成分復方的生物活性高于其單味藥的現象，這可能與中獸醫的配伍理論有關，具體機制仍需進一步研究。

綜合以上結果，OAP增強雛雞對新城疫疫苗的免疫效果最好，可作為新型免疫增強劑的候選藥方。鑒于中、高劑量的效果多差異不顯著，推薦臨床使用OAP中劑量配合疫苗使用。

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