Mg2Al-Cl-LDH載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的研究

劉 莉， 林嘉鵬， 吳陽(yáng)升， 汪立芹， 田永芝， 黃俊成

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052;2.新疆畜牧科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部草食家畜繁育生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830000)

將DNA或者RNA轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中是生物化學(xué)和分子生物學(xué)目前主要的技術(shù)，導(dǎo)入的外源遺傳物質(zhì)會(huì)引起蛋白質(zhì)合成抑制或者是基因沉默。單獨(dú)的核酸物質(zhì)是不能夠穿過(guò)細(xì)胞壁的，所以需要有效的載體來(lái)運(yùn)輸［1］。常見運(yùn)輸載體有病毒、脂質(zhì)體和聚合物等，盡管大多數(shù)有關(guān)研究都注重于用病毒介導(dǎo)的方法將基因于體外和體內(nèi)送遞進(jìn)入細(xì)胞，然而非病毒基因載體由于其安全性高、易于制備和工藝放大、不會(huì)引起特異的免疫應(yīng)答等優(yōu)點(diǎn)而備受青睞。

Mg2Al-Cl-LDH是一種新型的潛在的投遞外源基因的載體。最近的研究結(jié)果表明，由于LDH納米顆粒具有獨(dú)特的化學(xué)性質(zhì)，所以具備一些獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。首先一個(gè)明顯的優(yōu)勢(shì)就是它具有可調(diào)節(jié)的陰離子夾層結(jié)構(gòu)，使其具有強(qiáng)負(fù)載能力把具有生物活性的物質(zhì)比如核酸分子插入其中［2］;其次它表面帶正電，能夠明顯地與細(xì)胞膜上帶負(fù)電的基團(tuán)發(fā)生吸附并跨過(guò)細(xì)胞膜;再次它具有單一的化學(xué)成分，所以顯示出低細(xì)胞毒素和高生物相溶性［3］。

Xu等［4］用LDH與pEF-eGFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞，其轉(zhuǎn)染效率是脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的7% ～15%。Ladewig等［5］用 Mg2Al(OH)6NO3LDH 納米顆粒材料與質(zhì)粒DNA共轉(zhuǎn)染HEK293T、NIH3T3、COS-7和CHO-K1等貼壁細(xì)胞系，但無(wú)法轉(zhuǎn)染懸浮培養(yǎng)的CHO-S細(xì)胞，還發(fā)現(xiàn)制備LDH復(fù)合溶液條件的改變會(huì)影響納米粒子在懸濁液中的分散度。本研究利用合成的LDH懸濁液與pEGFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，設(shè)計(jì)不同LDH濃度和不同轉(zhuǎn)染時(shí)間，并分別檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率，希望對(duì)今后納米材料在細(xì)胞轉(zhuǎn)染、運(yùn)輸干擾RNA及藥物治療載體等生物技術(shù)領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

293T及C2C12細(xì)胞由新疆畜牧科學(xué)院綿羊中心實(shí)驗(yàn)室保存;培養(yǎng)細(xì)胞器皿及耗材購(gòu)自上海生工生物公司;GFP質(zhì)粒由新疆畜牧科學(xué)院綿羊中心實(shí)驗(yàn)室制備。標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清FBS從Hyclone公司購(gòu)買;DEME培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自Gibco公司;甘氨酸購(gòu)自Bio-Rad公司;脂質(zhì)體Lipofectamine 2000從Invtitrogen公司購(gòu)買;化學(xué)試劑購(gòu)自天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 LDH的制備 配制A溶液(含0.3 mmol/L MgCl2和 0.1 mmol/L AlCl3):稱 取0.609 9 g MgCl2·6H2O 和 0.241 4 g AlCl3·6H2O，溶于 10 ml去離子水中;配制B溶液(0.15 mmol/L NaOH):稱取0.240 g NaOH，溶于40 m l去離子水中。將10 ml A溶液邊攪拌邊加入40 m l B溶液中。將混合液隔絕空氣磁力攪拌10 min。4 500 r/min離心10 min，將沉淀洗滌2次。將沉淀溶于40 ml去離子水中，37 ℃ 300 r/min攪拌10 min，并定容到45 ml，放入特制的不銹鋼皿中。100℃加熱16 h。將混合液自然冷卻到室溫，放置備用。

1.2.2 LDH表型的測(cè)定 將10μl LDH加入到90 μl無(wú)水乙醇中，振蕩混勻10 min，然后進(jìn)行透射電鏡掃描。

1.2.3 LDH轉(zhuǎn)染細(xì)胞 將凍存在液氮中的293T細(xì)胞取出，迅速加入到40℃的水中，快速攪動(dòng)，待細(xì)胞完全融化，將其轉(zhuǎn)移到15 ml離心管中，并加入5 m l D-Hanks溶液，3 000 r/min離心10 min，棄上清，將底層細(xì)胞分散在7 ml 10%FBS培養(yǎng)基中。在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。C2C12細(xì)胞同法處理。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)到95%以上時(shí)進(jìn)行傳代，小心倒掉原有培養(yǎng)基，用4 ml D-Hanks溶液輕輕晃動(dòng)清洗細(xì)胞后將液體倒掉，重復(fù)此步驟;再加入500μl胰酶，上下、左右輕輕晃動(dòng)，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)放置2 min;取出后從培養(yǎng)瓶底部輕拍至所有細(xì)胞完全脫離瓶壁，加入5 ml DMEM吹散細(xì)胞，使其充分懸浮后棄去2ml懸浮液，將剩余細(xì)胞懸浮加入到7ml10%FBS培養(yǎng)基中，上下、左右、前后晃動(dòng)至分散均勻，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，傳至3～4代。C2C12細(xì)胞的培養(yǎng)方法同293T細(xì)胞的培養(yǎng)方法，將復(fù)蘇的C2C12細(xì)胞中加入10%FBS+100 U/mg青霉素+100 mg/L鏈霉素，培養(yǎng)至G3代。提取含有eGFP基因的質(zhì)粒，取 LDH(0.80%)100 μl和質(zhì)粒(1.6 μg/μl)20 μl混合30 min。將混合物離心10 min，將沉淀重懸于1 ml 10%血清培養(yǎng)基中，靜置10 min。與此同時(shí)，將6孔板中的細(xì)胞用1%Dhanks沖洗細(xì)胞2遍后，加入2 ml 10%血清培養(yǎng)基。將LDH混合液加入孔中，搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻。在37℃、5%CO2中保溫3 h。之后，更換含有10%血清的培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2中保溫12～72 h檢測(cè)轉(zhuǎn)染水平。根據(jù)不同DNA/LDH的質(zhì)量比(0/50～10/50)，根據(jù)不同的培養(yǎng)時(shí)間(12 h、24 h、36 h、48 h、56 h)，設(shè)計(jì)梯度試驗(yàn)。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 在平板中加入胰蛋白酶將細(xì)胞消化下來(lái)，用1×PBS洗1遍，4 500 r/min離心10 min，重復(fù)此步驟3遍。之后將細(xì)胞重懸于10 ml雙蒸水中，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 Mg2 Al-Cl-LDH顆粒的結(jié)構(gòu)

Mg2Al-Cl-LDH是層狀雙氫氧化物，由二價(jià)的鎂離子和三價(jià)的鋁離子組成，化學(xué)組成式為Mg2Al(OH)6(Cl)·1.5H2O，它是具有水滑石層狀晶體結(jié)構(gòu)的混合金屬氧化物，其基本結(jié)構(gòu)單元是鎂鋁氫氧化物六邊形結(jié)構(gòu)層，其片面重疊形成水滑石晶體顆粒。在150 000×透射電鏡下觀察，Mg2Al-Cl-LDH顆粒大小有差異，顆粒直徑主要分布在100 nm左右(圖1)。

圖1 M g2 A l-Cl-LDH顆粒在透射電鏡下的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of Mg2 Al-Cl-LDH particles in a transmission electron microscope

2.2 Mg2 Al-Cl-LDH的細(xì)胞毒性

以不同濃度(0～500μg/ml)的LDH懸液加入到每孔含有4×105個(gè)細(xì)胞的平板中，在CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h后，檢測(cè)細(xì)胞活性。納米顆粒在轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，隨著顆粒濃度的增加，細(xì)胞活性呈先下降后上升再下降的趨勢(shì)(圖2)。當(dāng)LDH濃度過(guò)高時(shí)，細(xì)胞無(wú)法胞吞過(guò)多的納米顆粒，過(guò)多的顆粒分散在細(xì)胞培養(yǎng)基中，使細(xì)胞的呼吸和生長(zhǎng)都受到影響，最終使細(xì)胞活性下降甚至死亡。LDH濃度為200 μg/ml時(shí)，細(xì)胞活性比較強(qiáng)，但是與其他濃度之間的差異不大，當(dāng)LDH濃度為500μg/ml時(shí)細(xì)胞活性下降非常快。

比較脂質(zhì)體和納米轉(zhuǎn)染結(jié)果可見，納米材料與脂質(zhì)體同轉(zhuǎn)染10μg/ml熒光質(zhì)粒時(shí)，納米材料的轉(zhuǎn)染效果不如脂質(zhì)體理想。

圖2 不同LDH濃度下的細(xì)胞毒性測(cè)定Fig.2 Cytotoxicity in different concentrations of LDH

2.3 Mg2 Al-Cl-LDH納米材料轉(zhuǎn)染細(xì)胞體系的建立

LDH作為投遞基因的載體，攜帶eGFP基因進(jìn)入細(xì)胞，其表達(dá)的蛋白質(zhì)具有熒光，因此可以用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，從而判斷轉(zhuǎn)染效率的水平。以不同DNA/LDH質(zhì)量比(0/50～10/50)進(jìn)行試驗(yàn)，流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示4/50的比例下轉(zhuǎn)染效率最高，達(dá)到了11.17%(圖3)。

圖3 不同DNA/LDH質(zhì)量比下的轉(zhuǎn)染效率Fig.3 The efficiency of transfection of the system with differentmass ratios of DNA/LDH

在LDH和質(zhì)粒DNA混合反應(yīng)的過(guò)程中，時(shí)間對(duì)反應(yīng)是有影響的，隨著時(shí)間從5 min到30 min，兩者相互吸附的數(shù)量呈先上升后下降的趨勢(shì)(圖4)。在15 min時(shí)相互吸附的數(shù)量最多，轉(zhuǎn)染后表達(dá)的熒光蛋白質(zhì)也最多，轉(zhuǎn)染率達(dá)到最高值(6.07%)。

圖4 不同的DNA和LDH反應(yīng)時(shí)間下的轉(zhuǎn)染效率Fig.4 Transfection efficiency of the system with different reaction time of DNA and LDH

當(dāng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，從12 h時(shí)的轉(zhuǎn)染率3.5%上升達(dá)到48 h時(shí)的最大值12.6%，隨后出現(xiàn)下降的趨勢(shì)(圖5)。在72 h時(shí)由于細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間過(guò)久，密度過(guò)大，細(xì)胞無(wú)法正常呼吸和生長(zhǎng)，活性降低，活細(xì)胞數(shù)量降低，表達(dá)出的GFP蛋白質(zhì)也減少。當(dāng)轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞時(shí)也呈現(xiàn)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)先上升后下降的趨勢(shì)，但是C2C12細(xì)胞的平均轉(zhuǎn)染率比293T細(xì)胞高，平均轉(zhuǎn)染率達(dá)到13.6%，最大值為17.4%。

因此確定Mg2Al-Cl-LDH納米材料轉(zhuǎn)染細(xì)胞體系:DNA/LDH的質(zhì)量比為4/50，DNA與LDH的混合時(shí)間為15 min，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間為48 h，納米顆粒濃度為200 mg/L。

圖5 HEK 293T和C2 C12細(xì)胞在不同培養(yǎng)時(shí)間下的轉(zhuǎn)染效率Fig.5 Transfection efficiencies of HEK 293T cells and C2 C12 cells cultured for different time

3 討論

3.1 Mg2 Al-Cl-LDH顆粒的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)

有研究結(jié)果表明Mg2Al-Cl-LDH中由于高價(jià)的Al3+取代了部分低價(jià)的 Mg2+，使得正電荷過(guò)剩，Mg2Al-Cl-LDH帶正電，這些過(guò)剩的正電荷由反離子平衡，反離子和部分水分子存在于兩個(gè)類水鎂石片中間的間隙里而層板上有氫氧基團(tuán)，它的堿性位可使其與其他化合物反應(yīng)，從而提供了豐富的堿中心，使其更穩(wěn)定。另外LDH間層的陰離子可在一定條件下與各種功能陰離子進(jìn)行交換，使LDH成為具有應(yīng)用性能的超分子插層結(jié)構(gòu)材料［6］。通過(guò)插層使體積較大的陰離子取代體積較小的陰離子進(jìn)入層間，得到更多的反應(yīng)空間和暴露更多的活性中心，使它的催化性能更為顯著［7］。并且其粒子大小及粒子分布可以通過(guò)合成方法和條件進(jìn)行控制，本試驗(yàn)中Mg2Al-Cl-LDH顆粒直徑主要分布在100 nm左右。

然而納米顆粒制作后，在透射電鏡下還是可以看到一些沒有結(jié)合的分子晶體，說(shuō)明結(jié)合效率不能達(dá)到100%。并且Mg2Al-Cl-LDH顆粒是不穩(wěn)定的，放置一周之內(nèi)，顆粒狀態(tài)比較穩(wěn)定，顆粒分散均勻，懸液顏色清澈，但是時(shí)間超過(guò)一周，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，顆粒出現(xiàn)團(tuán)集，形成大分子的顆粒，懸液也變得渾濁，從而影響轉(zhuǎn)染效率。

3.2 Mg2 Al-Cl-LDH顆粒與質(zhì)粒DNA的作用

Mg2Al-Cl-LDH顆粒有“質(zhì)子海綿效應(yīng)”，因此能夠通過(guò)靜電吸附作用攜帶帶負(fù)電荷的基因物質(zhì)如寡核苷酸，通過(guò)空間位阻效應(yīng)，防止體內(nèi)DNA酶對(duì)寡核苷酸的降解，并且能夠?qū)?fù)合的 DNA運(yùn)送到細(xì)胞核內(nèi)，實(shí)現(xiàn)有效的基因轉(zhuǎn)染［8］。在復(fù)合的過(guò)程中，由于納米顆粒整體呈現(xiàn)堿性，帶負(fù)電荷的Cl-離子位于雙層結(jié)構(gòu)的中間，帶正電荷的離子會(huì)延展到雙層結(jié)構(gòu)的外部，與帶負(fù)電的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)相互復(fù)合。因此當(dāng)納米顆粒與核酸物質(zhì)相結(jié)合的時(shí)候，核酸物質(zhì)的負(fù)電荷與納米顆粒的正電荷隨著濃度的變化，兩者的結(jié)合能力也發(fā)生著變化，本試驗(yàn)中DNA/LDH質(zhì)量比為4/50時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高，可能就是因?yàn)榇藭r(shí)的正負(fù)電荷比例最恰當(dāng)。同時(shí)兩者電荷比例的變化還會(huì)降低由過(guò)強(qiáng)正電荷產(chǎn)生的載體本身的細(xì)胞毒性，也可增加轉(zhuǎn)染效率，本試驗(yàn)中200 μg/m l納米顆粒濃度下細(xì)胞活性還可達(dá)到83%。隨著時(shí)間的變化，兩者的復(fù)合數(shù)量先增加然后減少，說(shuō)明兩者的復(fù)合作用是不穩(wěn)定的，在15 min時(shí)，穩(wěn)定性比較高。Mg2Al-Cl-LDH是可生物降解的高分子材料，當(dāng)濃度達(dá)到200μg/ml時(shí)細(xì)胞活性還是比較強(qiáng)的，然而達(dá)到500μg/ml時(shí)細(xì)胞活性下降非常快，說(shuō)明即使納米顆粒可降解，但是還是有細(xì)胞毒性的。

3.3 Mg2 Al-Cl-LDH顆粒與細(xì)胞膜的相互作用

因?yàn)镸g2Al-Cl-LDH顆粒與DNA分子相互結(jié)合后形成的團(tuán)聚體正好能夠被細(xì)胞胞吞，并且能夠在細(xì)胞漿內(nèi)釋放DNA分子進(jìn)入細(xì)胞，有人認(rèn)為，納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞主要取決于顆粒的粒徑大小［9］。當(dāng)顆粒粒徑在小于200 nm時(shí)，細(xì)胞容易以網(wǎng)格蛋白質(zhì)介導(dǎo)的主動(dòng)胞吞方式將顆粒胞吞入細(xì)胞;而500 nm左右的顆粒以細(xì)胞質(zhì)膜微囊的胞吞方式進(jìn)入細(xì)胞。Mg2Al-Cl-LDH顆粒大小為100 nm左右，因此推測(cè)本試驗(yàn)納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程應(yīng)該與網(wǎng)格蛋白質(zhì)的介導(dǎo)有關(guān)［10］。然而不同細(xì)胞的網(wǎng)格蛋白質(zhì)數(shù)量和介導(dǎo)能力可能不同，所以出現(xiàn)了293T和C2C12細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率不同，也有可能是細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)用的都是六孔板，C2C12的細(xì)胞形態(tài)大，相對(duì)生長(zhǎng)密度就小，相對(duì)轉(zhuǎn)染效率就高。與脂質(zhì)體相比，無(wú)論是使用293T細(xì)胞還是C2C12細(xì)胞，納米顆粒的轉(zhuǎn)染效率都還是比較低的，然而納米載體具有安全性高、易于制備和工藝放大、不會(huì)引起特異的免疫應(yīng)答等優(yōu)勢(shì)。

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