HPLC 測(cè)定大菟絲子中的咖啡酸含量和薄層鑒別

歐恒熙 鮑家科 曹詩偉 劉 玲

1.貴陽醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州 貴陽 550004;2.貴州省藥品審評(píng)認(rèn)證中心，貴州 貴陽 550004;3.貴州神奇藥業(yè)股份有限公司，貴州 貴陽 550004

大菟絲子為旋花科 (Cuscutaceae)菟絲子屬 (Cuscuta)植物金燈藤 (Cuscuta japonica Choisy)全草的種子，又名日本菟絲子，始載于《本經(jīng)》、《別錄》［1］。大菟絲子為中藥菟絲子的常見商品藥材之一，也是我國(guó)西南地區(qū)收載于藥材地方標(biāo)準(zhǔn)的習(xí)用藥材。具有滋補(bǔ)肝腎，固精縮尿，安胎，明目，止瀉等功能［2］。大菟絲子的定性、定量分析目前未見報(bào)道。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道本品含大量淀粉酶、維生素A類物質(zhì)及樹脂樣配糖體，紙層析檢查櫟精類及新綠原酸組成的苷類等黃酮化合物［3］，郭洪祝，李家實(shí)［4］報(bào)道其中還含有咖啡酸、β-谷甾醇、花生酸、胡蘿卜苷。本文以咖啡酸為指標(biāo)性成分，建立大菟絲子藥材中咖啡酸的高效液相色譜 (HPLC)測(cè)定方法和薄層色譜 (TLC)鑒別，并對(duì)不同產(chǎn)地大菟絲子中的咖啡酸進(jìn)行比較，以其為大菟絲子的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 日本島津LC-20AD高效液相色譜儀 (SPDM20A二極管陣列檢測(cè)器、CBM-20A系統(tǒng)控制器、CTO-20AC柱溫箱、LC-20AT泵、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、LC2000色譜數(shù)據(jù)工作站)，XS205型電子分析天平 (梅特勒-托利多儀器有限公司)，CH-300型超聲波清洗機(jī) (北京創(chuàng)新德超聲電子研究所)，DK-98-11A型電熱恒溫水浴鍋 (天津市泰斯特儀器有限公司)，中藥材粉碎機(jī) (浙江溫嶺市林大機(jī)械有限公司)。

1.2 試藥 咖啡酸 (批號(hào) 110885-200102，由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供)、硅膠G薄層板 (青島海洋化工廠)，甲醇為色譜純、分析純，其余試劑均為分析純，水為重蒸餾水。10批大菟絲子樣品，均由貴陽中醫(yī)學(xué)院陳德媛研究員鑒定為為旋花科植物金燈藤Cuscutaceae的全草的種子。藥材來源見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 取咖啡酸對(duì)照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取本品粉末1g，加5%甲酸的甲醇溶液20ml，超聲處理20min，放置過夜，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0ml使其溶解，濾過，濾液用乙酸乙酯振搖提取2次，每次10ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使其溶解，作為供試品溶液。

2.1.3 薄層色譜條件及其結(jié)果 照薄層色譜法 (2010年版《中國(guó)藥典》一部附錄Ⅵ B)試驗(yàn)［8］，吸取上述兩種溶液各6 μl，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素納為黏合劑的硅膠G薄層板上，以乙酸丁酯-甲酸-水 (7∶2.5∶2.5) 上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，105℃加熱至斑點(diǎn)清晰。置紫外燈 (365nm)下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。結(jié)果表明，10批不同產(chǎn)地大菟絲子藥材與對(duì)照品比較均能出現(xiàn)相同Rf值斑點(diǎn)。見圖1。

2.2 咖啡酸含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Diamosil C18色譜柱 (4.6mm×200mm，5μm);以甲醇-0.1%磷酸溶液 (75∶25) 為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)：325nm;柱溫：30℃;流速：1.0ml/min;進(jìn)樣量：10μl。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取在110℃干燥于恒重的咖啡酸對(duì)照品 1.52mg、12.5mg，分別置于 10ml、5ml棕色量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得咖啡酸濃度為0.1520mg/ml、2.500mg/ml的對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取大菟絲子粉末 (過四號(hào)篩)約0.5g，精密稱定，置50ml具塞錐形瓶中，精密加入5%的甲酸甲醇溶液10ml，密塞，搖勻，稱定重量，過夜，超聲處理30分鐘，取出，再稱定重量，用5%的甲酸甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，取上清液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，避光保存?zhèn)溆茫吹茫?］。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取咖啡酸對(duì)照品溶液 (咖啡酸 C=0.1520mg/ml)2、4、6、8、10、12、14μl進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定色譜峰面積，以峰面積A對(duì)進(jìn)樣量(μg)進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得線性回歸方程為：A咖啡酸=9.6 × 105X-69203，R2=0.9999。咖啡酸在 0.3040 ～2.1280μg，與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取咖啡酸對(duì)照品溶液 (咖啡酸C=0.1520mg/ml)10μl，連續(xù)進(jìn)樣5次測(cè)定，咖啡酸峰面值的RSD為0.3%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液 (2號(hào)樣品)，分別于0、4、8、24h進(jìn)樣 10μl測(cè)定，咖啡酸面積值 RSD為0.7%，表明供試品溶液在24h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 對(duì)同一批大菟絲子藥材 (2號(hào)樣品)平行制備5份供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，按干燥品計(jì)算其咖啡酸含量，其RSD分別為2.3%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同一大菟絲子藥材粉末(含咖啡酸2.4839 mg·g-1)5份，各約0.5 g，每份等量加入咖啡酸 (C=2.500mg/ml)，按“2.2.3”項(xiàng)下進(jìn)行樣品制備并測(cè)定，計(jì)算回收率。咖啡酸的平均回收率為100.03%，RSD為0.2%，測(cè)定結(jié)果見表2。

2.2.9 樣品測(cè)定 按“2.2.3”項(xiàng)，對(duì)10批大菟絲子藥材進(jìn)行測(cè)定，每批平行測(cè)定兩份，測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 藥材來源及樣品含量測(cè)定結(jié)果

根據(jù)10批樣品測(cè)定結(jié)果分析，測(cè)定結(jié)果咖啡酸含量最高值2.9763mg/g，平均值為2.6439mg/g，各批次樣品中咖啡酸含量相差不大。故暫定大菟絲子含咖啡酸不得少于 0.2%。

表2 咖啡酸加樣回收率試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 大菟絲子藥材在我國(guó)西南地區(qū)被廣泛運(yùn)用，但關(guān)于它的含量測(cè)定的文獻(xiàn)未見報(bào)道，本文建立了大菟絲子藥材不同產(chǎn)地的咖啡酸的含量檢測(cè)和TLC鑒別，所建方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可行，重現(xiàn)性好，可適用于對(duì)大菟絲子藥材的質(zhì)量控制。

3.2 按2010版藥典蒲公英標(biāo)準(zhǔn)中的咖啡酸HPLC的含量測(cè)定方法，以甲醇 -磷酸鹽緩沖液 (23∶77)為流動(dòng)相［5］;在323nm的波長(zhǎng)處有最大吸收，基線較穩(wěn)。在本實(shí)驗(yàn)中用甲醇-0.1%磷酸 (25∶75)的流動(dòng)相，在325nm的波長(zhǎng)處和上述流動(dòng)相作比較，后者基線更為穩(wěn)定，并且減少對(duì)柱子的損害。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)也采用直接加甲醇超聲30min和照《2010年版藥典》加5%的甲酸甲醇溶液超聲30min，放冷，直接測(cè)定其含量的方法，但對(duì)照和樣品的出峰時(shí)間都不吻合。以此筆者推斷大菟絲子中游歷咖啡酸存在很少，而大多是以苷的形式存在于藥材中。所以本實(shí)驗(yàn)加5%的甲酸甲醇溶液，放置過夜進(jìn)行酸水解出咖啡酸來測(cè)定其含量。

3.3 本實(shí)驗(yàn)還采用上述相同的處理方法，鑒別和測(cè)定菟絲子藥材中咖啡酸的含量，并未發(fā)現(xiàn)其有咖啡酸的成分。故此可否作為兩種藥材的區(qū)分鑒別依據(jù)值得進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

［1］《中華本草》編委會(huì).中華本草［M］.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999：5864.

［2］貴州省藥品監(jiān)督管理局.貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) (2003年版)［M］.貴陽：貴州科技出版社，2003.

［3］ Tronchet J.Ann.Sci.Univ.Besancon.Botan .1962;2(18)101.See.CA.1963，59：18109.

［4］郭洪祝，李家實(shí)，吳楠，等.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，23(2).

［5］中國(guó)藥典委員會(huì).中國(guó)藥典 (一部)［S］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：331.