UPLC 法測定兒童血漿中維生素A

張 楨，楊躍煌，孫幫燕

1.昆明市兒童醫院檢驗科/昆明醫科大學附屬兒童醫院中心實驗室，云南 昆明 650028 2.大理學院藥學院，云南 大理 671000

脂溶性維生素A是人類機體維持正常代謝和機能的必需物質，對兒童骨骼、視力發育、粘膜生長和生殖功能影響尤為重要，測定兒童血漿中脂溶性維生素A的濃度，不僅可以了解脂溶性維生素A營養狀況，而且可以為合理補充脂溶性維生素 A提供依據［1－5］。

1 儀器及試劑

Waters－ACQUITY－UPLC超高效液相色譜儀(Waters，美國)，Empower數據處理系統，Sar－torius BT125D電子天平(德國賽多利斯儀器系統有限公司)，MULTIFUGE X1R超高速離心機(Thermo，美國)，XW－80A渦旋混合器(上海醫科大學儀器廠)。

對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:100138－200603);甲醇:色譜純(美國Fisher公司);水:自制超純水，水機(PURELAB ELGA公司，英國)。

2 色譜條件 色譜條件:色譜柱為BEH C18柱(50 mm×2.1

3 樣品測定

3.1 儲備液的配制 取Vitamin A對照品約5mg，精密稱定，置50ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得濃度約為1000 mg·L－1的儲備液。

3.2 血樣預處理:取血漿200μl，加入140μl甲醇和異丙醇(v/v，8:2)，渦旋30s后，加入1000ul正已烷，渦旋1min，室溫高速離心2min(12000×g)，取上清液700μl，吹干后甲醇 100 μl復溶。

4 線性關系和線性范圍

取空白血漿200μl共6份，分別加入不同濃度Vitamin A 50μl，配成濃度為 50，100，200，400，800，1000μg/L 溶液，按“3.2血樣預處理”操作，以濃度與峰面積作線性回歸，得標準曲線方程。y=3739.5x+3073.5，R2=0.9996，線線性范圍為50～1000μg/L。

5 方法專屬性

按“3.2血樣預處理”處理方法和色譜條件，不受血漿中內源性雜質的干擾，見圖1－2.

圖1 標準品維生素A經“3.2”處理后濃度為400μg/L色譜圖(保留時間為2.098)

圖2 正常兒童血漿加標準品維生素A經“3.2”處理后濃度為500μg/L－1色譜圖(保留時間為2.098)

6 回收率實驗

標本加入0.5～2倍標準品后，按3.2處理，計算回收率，結果見表1。

表1 回收率統計表

7 穩定性實驗

7.1 儲備液穩定性考察，取儲備液分別在1，3，5，7天，配制標準使用液80，400，700μg/L直接進樣測定，峰面積RSD分別為1.1，1.72，2.7%，表明儲備液至少在7天穩定。

7.2 樣穩定性考察 用正常兒童血漿進行精密度試驗，由回歸方程計算實際濃度，日內與日間精密度最大值分別為2.1，5.1%。

8 臨床應用 檢測了300例正常兒童血漿，維生素A濃度于臨床相符，測定值在300～802μg/L之間。

9 討論

利用維生素A分子中具有共軛多烯醇的側鏈結構，在325～328nm的范圍內有紫外最大吸收，用于含量測定［7］。樣品處理方法簡便與快速:經液液萃取后經氮氣蒸發，能滿足臨床快速測定兒童血漿中維生素A含量需求。

［1］李發美.醫藥高效液相色譜技術［M］.北京:人民衛生出版社，1999:243－244.

［2］Kamisha L.Johnson－Davis，Steve J.Moore，William E.Owen，Jeaneah M.Cutler，ElizabethL.Frank .A rapid HPLC methodused to establish pediatric reference intervals for vitamins A and E［J］.Clinica Chimica Acta，2009，405:35－38

［3］侯曉清.HPLC法同時測定人中血清維生素A和維生素E［J］.中國藥學雜志，1997，3(1):28－31.

［4］J.M.Mata－Granados，M.D.Luque de Castro，J.M.Quesada.Fully automated method for the determination of 24，25(OH)2and 25(OH)D3 hydroxyvitamins，and Vitamins A and E in human serum by HPLC［J］.Journal of PharmaceuticaLAnd BiomedicaLAnalysis，2004，35:575 –582.

［5］M.R.Brunetto，M.A.Obando，M.Gallignani，O.M.Alarcón，E.Nieto，R.Salinas，J.L.Burguera，M.Burguera.HPLC determination of Vitamin D3 and its metabolite in human plasma with on－line sample clean up［J］.Talanta，2004，64:1364 –1370.

［6］國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典(2010年版二部)［M］.北京:化學工業出版社，2010.

［7］劉文英.藥物分析［M］.北京:人民衛生出版社，2008:245.