護骨膠囊配伍和成骨細胞分化的正交設計

王曉東， 賈歡歡， 曾昭利， 曾 雯， 秦中華， 萬 超， 陸幸妍， 李青南，胡 彬

(1.廣東藥學院附屬第一醫院骨外科，廣東廣州 510080;2.廣東省實驗動物監測所，廣東廣州 510663;3.東莞萬成制藥有限公司，廣東東莞 523040;4.香港中文大學醫學院生物醫學學院干細胞與再生醫學中心，香港;5.廣東藥學院生命科學與生物制藥學院新藥功能研究中心，廣東廣州 510006;6.紐約大學牙科生物材料和仿生學研究室，美國紐約 10010)

骨質疏松癥 (Osteoporosis)是以骨量減少、骨微觀結構退化為特征，致使骨的脆性和骨折危險性增加的系列性多病因的一種全身骨骼疾病［1-2］。成骨細胞 (osteoblasts)作為骨形成的主要功能細胞，是目前大多數防治骨質硫松癥藥物的主要靶細胞之一［3］。其合成分泌的堿性磷酸酶 (Alkaline phosphatase，AKP)被作為考察成骨細胞分化的主要指標［4］。護骨膠囊是在中醫理論指導下形成的國家中藥新藥 (新藥證書編號:國藥證字Z20040106)，研究發現護骨膠囊對原發性骨質硫松癥有一定的防治作用［5］，但臨床反饋，老年人服藥量略微偏大。本實驗采用正交模擬法［6］和非線性混合效應模型 (NONMEM)技術［7-9］，以AKP為考察指標，優化護骨膠囊的配伍組方。

正交模擬法是由上海中醫藥大學鄭青山教授提出，用以定量考察復方各組分的藥效貢獻及其配伍規律的藥效學實驗方法。遵循這種規律性設計，可以最少的實驗次數獲取最優化的復方配伍［10］。

1 材料

1.1 藥物與試劑 護骨膠囊十味原藥材東莞萬成制藥有限公司提供;堿性磷酸酶 (AKP)測定試劑盒南京建成生物工程研究所生產，批號:20100630。

1.2 動物 2月齡SD大鼠24只，雌雄各半，體質量 (200±10)g，合格證號:0074494及0074528;SD乳鼠3只，合格證號:SCXK(粵)2008-0020，雌雄兼用，每只約15 g。均由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供。

1.3 儀器 Microplate Reader 680酶標儀，美國Biorad公司;J-D200倒置生物顯微鏡，深圳拓天儀器設備有限公司;Galaxy二氧化碳培養箱，英國RS Biotech公司。

2 方法

2.1 護骨膠囊原方組成 護骨膠囊由以下十味藥材組成:淫羊藿 (A)277.5 g，巴戟天 (B)277.5 g，骨碎補 (C)277.5 g，杜仲 (D)277.5 g，續斷 (E)277.5 g，制首烏 (F)347.5 g，熟地黃 (G)347.5 g，龜甲 (H)208.5 g，當歸(I)208.5 g，山藥 (J)277.5 g。

表1 正交設計Tab.1 Orthogonal array

2.2 分組與給藥 護骨膠囊十個組分ABCDEFGHIJ按表1設計，組成12個組方，煎煮液濃縮至0.1 g/mL。每組2只大鼠灌胃0.2 mL/(kg·d)，雌雄各半，連續7 d。根據護骨膠囊的成人服用量，按照標準動物的等效劑量折算系數法［11］計算出護骨膠囊原藥材的大鼠給藥量，可以折算出每組大鼠的給藥量，計算結果見表2。各組給藥結束后30 min心臟取血，4 000 r/min離心15 min分離大鼠血清，將雌雄大鼠血清混合，采用血清藥理學的方法制成10%的含藥血清，作用于源自大鼠乳鼠頭蓋骨的原代培養至第3代的成骨細胞，檢測各組470 nm培養成骨細胞上清的AKP吸光度 (A)值［12-13］。數值大代表藥效越強。

表2 各組分二水平設置 (g/kg)Tab.2 Set 2 levels of each component(g/kg)

2.3 分析模型與原理［14］采用正交模擬法及NONMEM法評價模型對實驗數據進行分析。采用最簡單的A、B兩組分組方來說明此方法的原理，Eobs為實測效應，E0表示基線效應;Ea和Eb為 A、B組分對復方效應的期望貢獻值。

(1)基礎模型模型 (式1)，可確定各組分對復方的貢獻值大小 (Eexp)，即重要程度。

(2)固定效應模型 (式2)，可確定各配伍組的相互作用 (Eab)。

(3)隨機效應模型 (式3)，可分析個體間 (η)和個體內 (ε)變異 (Erand)大小。

(4)復方預測藥效模型 (式4)，可預測不同組方的效應 (Epred)，尋找最大藥效和最優組方。

2.4 模型評價 采用單組分實驗結果及4種常規視圖對預測模型進行評價［9］。

3 結果

3.1 成骨細胞形態學觀察鑒定 原代細胞貼壁前呈均勻一致的球形，24 h左右開始貼壁，72 h完全貼壁，并且胞漿伸展，呈飽滿的多角形。10 d之后出現細胞融合，大多呈立方體形。

3.2 成骨細胞堿性磷酸酶 (AKP)檢測 條件培養基可以誘導頭蓋骨骨髓間充質干細胞轉化為成骨細胞，以AKP作為成骨細胞分化的指標，檢測發現使用條件培養基培養細胞的上清液470 nm波長的A值0.164 0±0.003明顯高于使用普通培養基的A值0.034 3±0.002 1(P＜0.05)。

3.3 護骨膠囊模擬組方對成骨細胞分化的影響與原方 (第1組)比較，所有實驗組均有統計學差異 (P＜0.05)，且組4的A值大于組 1，見表3。

3.4 藥效學參數分析 復方藥效學參數列于下表，以基線效應為標準。應用DAS3.0軟件分析12個組的A值，比較各組分“用藥”與“不用藥”的藥效變化，確定各組分的重要性，實為該組分對復方的藥效貢獻值ED，反映各自重要程度［6］，結果見表4。由表4可以發現，有五味藥對成骨細胞分化有促進作用，而骨碎補 (C)、何首烏 (F)對成骨細胞分化無作用 (P＞0.05)，續斷 (E)、龜甲 (H)、當歸 (I)對成骨細胞分化則有抑制作用(ED＜0);各味藥對成骨細胞分化作用的影響大小，排序為淫羊藿 (A) ＞山藥 (J) ＞巴戟天(B)=熟地黃 (G)＞杜仲 (D)＞骨碎補 (C)＞何首烏 (F) ＞龜甲 (H) ＞當歸 (I) ＞續斷(E)。

表3 各組血清培養成骨細胞470 nm A值 (±s，n=3)Tab.3 Absorbance values of each group serum culture osteoblast(±s，n=3)

表3 各組血清培養成骨細胞470 nm A值 (±s，n=3)Tab.3 Absorbance values of each group serum culture osteoblast(±s，n=3)

注:與原方 (第1組)比較，*P＜0.05。

配伍組號 A RSD/%1 0.184 0±0.011 5 6.3 2 0.166 7±0.013 0* 7.8 3 0.158 7±0.006 7* 4.2 4 0.187 0±0.011 5* 6.2 5 0.133 3±0.008 5* 6.4 6 0.158 7±0.010 5* 6.6 7 0.164 0±0.003 0* 1.8 8 0.146 7±0.007 2* 4.9 9 0.157 7±0.007 2* 4.6 10 0.143 0±0.006 9* 4.8 11 0.145 7±0.009 3* 6.4 12 0.141 0±0.007 0*5.0

表4 各組分對復方藥效的估計值Tab.4 Pharmacodynamic forecast values of composition

3.5 相互作用分析 不同組合，由于其劑量水平不一，其相互作用性質和程序也有所不同，各配伍相互作用關系見表5。

3.6 復方藥效學模型評價 表6是在正交試驗12組數據的基礎上，采用正交模擬軟件DAS3.0對護骨膠囊不同組合的復方進行藥效模擬，得出29個模擬組方，并進行評價。通過藥效預測值Epred發現，29個預測組中最小效應組合為組2(Epred為0.144 5);最大效應組合為組1(Epred為0.226 3)，其次有5個組合的模擬藥效值接近于組1:組11(Epred為0.210 8)，組 15(Epred為0.204 9)，組 17(Epred為0.201 6)，組28(Epred為0.204 4)及組29(Epred為0.217 5)即原方，結果見表6及表7。

表5 不同組分配伍對的實測效應 (Eobs)、期望效應(Eexp)與交互效應 (Eint)Tab.5 Eobs，Eexpand Eintof different compositions

3.7 預測模型評價［14］通過本實驗2種視圖的結果，說明各配伍組藥效均值 (Egroup)與預測值(Epred)的趨勢線與標準線吻合較好 (圖1)，具有較好的相關性;個體實測值 (Eobs)與個體預測值(Eipred)間關系一致 (圖2)。此外，個體實測值(Eobs)與群體預測值 (Epred)的變化趨勢一致。

表6 不同組方的藥效預測值Epred及其95%CITab.6 Predicted value pharmacodynamics of simulation compound Epredand 95%CI

表7 6個較好的模擬組方Tab.7 Six better simulation compounds of pesticide effect

復方藥效學模型具有預測能力，且實驗數據離散度小 (在±4內)，具有可預測性。以上均表明所建模型較好，具有預測能力。

4 討論

當今，骨質疏松癥已成為嚴重威脅人類生活質量的疾病，國家已經將其列為重點攻關的老年三大疾病之一［15］。基于中藥護骨膠囊對原發性骨質疏松有良好的臨床療效，本實驗對處方配伍的優化將進一步拓寬其應用前景。

本研究以AKP為指標，結合正交模擬法理論上研究護骨膠囊十味藥的最佳配伍組合。以護骨膠囊各組分對復方藥效的貢獻值順序排列其重要程度，結果顯示，淫羊藿藥效的理論貢獻值大于其他藥味的貢獻值，進一步證明了淫羊藿作為護骨膠囊君藥的科學性。同時，本實驗對不同模擬組合的復方進行了藥效預測，發現29個模擬組中有6組具有較強的促分化作用:此排列順序為組方1、29(原方)、11、15、28和17，其中組方1只有原方中的6味藥，理論藥效最強，其值超過原組方。在組方構成上減少了續斷 (E)、龜甲 (H)及當歸(I)的組方1與護骨膠囊原方相比，對成骨細胞分化仍有較強的促進作用。

圖1 各配伍組藥效均值 (Egroup)與預測值 (Epred)的相關性Fig.1 Correlation of efficacy mean(Egroup)and predicted mean(Epred)

圖2 個體實測值 (Eobs)與個體預測值(Eipred)間關系Fig.2 Relationships of individual measured values(Eobs)and predicted values(Eipred)

另一方面，根據各味藥對護骨膠囊復方藥效的理論貢獻值，發現續斷 (E)、龜甲 (H)及當歸(I)對成骨細胞分化有抑制作用 (ED＜0)。

此外，本實驗室還采用成骨細胞增殖作為考察指標［16］，利用正交模擬法分析了護骨膠囊十味藥在原組方中對成骨細胞增殖的貢獻程度，結合本次實驗結果進一步分析發現，在原組方中，淫羊藿(A)、巴戟天 (B)、杜仲 (D)、熟地黃 (G)及山藥 (J)，這五味藥無論對成骨細胞的增殖還是分化都有較強的促進作用;骨碎補 (C)只對成骨細胞增殖有促進作用 (P＜0.05)，而對分化無影響 (P＞0.05);何首烏 (F)對成骨細胞增殖及分化均無影響 (P＞0.05);續斷 (E)、龜甲(H)及當歸 (I)對分化有抑制作用 (ED＜0)，但對增殖卻有一定的促進作用 (P＜0.05)。

從上述正交模擬法分析護骨膠囊各味藥的貢獻值和不同模擬組合獲得復方藥效數據，用細胞分化和細胞增殖為指標的各自實驗數據并不完全一致，提示護骨膠囊組方優化上還需要中醫經驗和中醫理論相結合分析和合理加減。

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