葛根芩連湯配伍對黃連生物堿腸吸收特性的影響

王 躍， 安 叡， 張藝竹， 肖 娟， 陳 燁， 王新宏

(上海中醫藥大學，上海 201203)

葛根芩連湯出自《傷寒論·太陽病上篇》，有清泄里熱、解肌散邪之功效，由葛根、黃芩、黃連、甘草四味藥組成，有效成分包括黃酮、生物堿類等［1］。葛根芩連湯為口服給藥，其有效成分必先經過腸道的吸收才能進入體內發揮藥效。

P-糖蛋白 (p-glycoprotein，P-gp)是一種由MDR1基因編碼的ATP依賴性膜轉運體，其在消化道上的表達極其廣泛［2］，近年來的研究發現腸道P-gp蛋白是影響藥物吸收及生物利用度的一個關鍵因素［3］，也是目前研究最多的腸道外排蛋白。葛根芩連湯中的有效成分小檗堿及其衍生物是P-gp的底物［4-5］，其口服生物利用度低的原因是P-gp的外排作用［6-7］。

本課題組的前期藥代動力學研究結果發現，葛根芩連湯中君藥葛根能促進黃連中生物堿成分的吸收。故本研究采用目前常用于研究藥物吸收機制的模型——大鼠腸外翻生物模型，從腸道轉運體P-gp的角度研究葛根芩連湯中黃連有效成分在不同配伍環境中的吸收動力學變化，希冀為探索葛根芩連湯的配伍機制提供科學依據。

1 實驗材料

1.1 實驗儀器 Waters AcquityTM H-Class超高效液相色譜儀 (PDA Detecter，Sample Manager-FTN，Quaternary Solvent Manager)，Empower2色譜工作站。

1.2 動物 SD大鼠，雄性，體質量 (200±20)g，由上海中醫藥大學實驗動物中心提供，合格證號:SCXK(滬)2008-0016。

1.3 藥品及試劑 葛根Puerariae lobatae Radix、黃芩Scutellariae Radix、黃連Coptidis Rhizoma購于上海康橋中藥飲片有限公司，炙甘草Glycyrrhizae Radix et Rhizoma praeparata cum melle購于上海金橋養和堂藥店;上述藥材經陳燕軍藥師鑒定，符合2010版《中國藥典》一部規定。鹽酸黃連堿(coptisine，批號:201011)購于上海經科化學科技有限公司;鹽酸藥根堿 (jatrorrhizine，批號:110733-201007)、鹽酸小檗堿 (berberine，批號:110713-200911)、鹽酸巴馬汀 (palmatine，批號:110732-200907)、鹽酸維拉帕米 (verapamil，批號:100223-200102)均購于中國藥品生物制品檢定所 (現為中國食品藥品檢定研究院)。甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 實驗方法

2.1 Tyrode緩沖液的配置 分別稱取NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，CaCl20.2 g，NaHCO31.0 g，NaH2PO40.05 g，MgCl20.1 g，葡萄糖 1.0 g，超純水定容到1 L，調節至pH 7.2～7.4。

2.2 標準品溶液的配置 精密稱取鹽酸黃連堿、鹽酸藥根堿、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀對照品適量，用甲醇配制成質量濃度分別為21.55、23.30、22.25、20.55 μg/mL的混合對照品貯備液 (以黃連堿、藥根堿、小檗堿、巴馬汀計)。取鹽酸維拉帕米適量，精密稱定，用超純水定容至10 mL，得3.96 mg/mL貯備液備用 (以維拉帕米計)。

2.3 腸外翻溶液的配置 葛根芩連湯全方由葛根15 g、黃芩9 g、黃連9 g、炙甘草6 g組成，按照全方各藥的比例確定各組藥物之間的比例稱取適量黃連、黃連-葛根 (黃連葛根質量比為3∶5)、黃連-黃芩 (黃連黃芩質量比為1∶1)、黃連-甘草(黃連甘草質量比為3∶2)，分別加8倍量水，煎煮30 min，過濾;再加8倍量水，煎煮30 min，過濾，合并兩次濾液，濃縮定容。取各提取液，用Tyrode緩沖液稀釋成黃連提取液、含100 μmol/L維拉帕米的黃連提取液、黃連-葛根提取液、黃連-黃芩提取液、黃連-甘草提取液，各組黃連生藥質量濃度均為5 mg/mL，冷藏備用。

2.4 動物手術 SD大鼠，實驗前禁食12 h，自由飲水。腹腔注射20%烏拉坦 (0.4 mL/100 g)麻醉，腹主動脈取血后，將大鼠腸管同腸系膜剝離，分別取十二指腸 (從幽門以下約10 cm)、空腸(十二指腸回腸中間腸段)、回腸 (從盲腸向上大約10 cm)、結腸 (盲腸向下)各7 cm，放入4℃Tyrode液中，將內容物沖洗干凈，然后小心剝離腸段表面的腸系膜和脂肪，將腸管翻轉，用Tyrode液沖洗后，腸管一端結扎塑料套管，另一端結扎，使之形成囊狀腸管。注入1 mL空白Tyrode液到腸囊內，放入已有Tyrode液的麥氏浴槽中，實驗過程中保持37℃恒溫循環水，并向浴槽中通入95%O2/5%CO2，平衡5 min。

2.5 腸外翻實驗 將平衡好的麥氏浴槽中的Tyrode液倒出，分別給予配置好的腸外翻溶液，分別在給藥15，30，45，60，90，120 min從腸囊內取樣200 μL，同時補足相同體積的空白Tyrode液。

2.6 樣品處理 取腸外翻實驗樣品200 μL，定量加入甲醇400 μL，渦旋混勻，14 000×g離心5 min，取上清液過微孔濾膜進樣分析。

2.7 腸外翻樣品中生物堿類成分的測定 ①色譜條件:Agilent Poroshell 120EC-C18色譜柱 (4.6 mm×50 mm，2.7-Micron);流動相0.2%乙酸水溶液 (A)-甲醇 (B)，梯度洗脫 (0～10 min，25% ～35%，B);體積流量1 mL/min;柱溫25℃;檢測波長345 nm;進樣量5 μL。②標準曲線制備:精密吸取混合對照品貯備液10.00、5.00、2.50、1.00、0.50 mL，分別置于50mL量瓶中，用空白Tyrode溶液稀釋至刻度，搖勻，取上述不同質量濃度的混合對照品溶液在上述色譜條件下進樣分析，以各成分質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行回歸計算。③精密度實驗:取已知質量濃度的混合對照品溶液，在確定色譜條件下連續進樣6次，考察日內和日間精密度。④專屬性實驗:在確定的色譜條件下，將混合對照品溶液和含藥的Tyrode液分別進樣檢測，考察方法的專屬性。⑤穩定性實驗:取腸外翻供試品，置于37℃水浴中，分別在0、2、4、8、12、24 h進樣檢測，考察樣品穩定性。⑥加樣回收率實驗:取已知量的供試品9份，分別精密加入對照品溶液適量，按樣品處理方法制備溶液，在上述色譜條件下進樣分析，計算平均加樣回收率。

3 數據分析

藥物累計吸收量按以下公式計算:

Q累計為藥物各時間的累積吸收量，Cn為n時間點的實際檢測濃度。

對藥物的累積吸收量對時間作相關回歸分析，得出的斜率 (L)除以吸收表面積 (A)求得吸收速率常數 (Ka，μg·min－1·cm－2)，公式如下。

4 結果

4.1 藥物濃度的測定 比較Tyrode液、混合對照品溶液、供試品溶液的色譜行為，結果表明在確定色譜條件下，各組分色譜峰處Tyrode液中物質和樣品中其他成分對待測組分沒有干擾，且各組分的峰形較好，能夠完全分離 (圖1)。求得標準曲線見表1，結果可見黃連各生物堿成分在考察質量濃度范圍內線性良好。本方法測定的各成分日間和日內精密度RSD均小于1%。穩定性實驗RSD小于2%。加樣回收率在98.3% ～100.4%之間，RSD小于2%(n=5)。

4.2 P-gp抑制劑對生物堿吸收的影響 取含有和不含維拉帕米的黃連提取液進行實驗，考察P-gp對生物堿的影響。結果顯示 (表2)，在各腸段，各生物堿的Ka值均有顯著性提高 (P＜0.05)，說明藥根堿、黃連堿、小檗堿、巴馬汀均為P-gp的底物。

圖1 空白tyrode液 (A)、標準品溶液 (B)和樣品 (C)的UPLC色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms of blank tyrode(A)，blank tyrode spiked with standard compounds(B)and samples(C)

表1 線性關系結果Tab.1 Result of linearity correlations

4.3 各配伍組對生物堿吸收的影響 各配伍組吸收常數Ka值如表3所示。配伍葛根后，在十二指腸、空腸段各生物堿比黃連組均有明顯的提高，其中小檗堿和巴馬汀的P＜0.01，同時在回腸段藥根堿的吸收也有增加。在黃芩的作用下，在回腸和結腸段黃連堿、小檗堿和巴馬汀均有顯著提高，其中在回腸段小檗堿和巴馬汀、結腸段巴馬汀的P＜0.01;在十二指腸段藥根堿和巴馬汀、空腸段巴馬汀的吸收也有提高。在甘草的作用下，僅僅在十二指腸段巴馬汀、回腸段藥根堿的吸收有所提高(以上P＜0.05)。

表2 維拉帕米對4種生物堿的腸吸收參數Ka值的影響［μg/(min·cm2)，n=5，±s］Tab.2 Effect of verapamil on Kaof coptisine，jatrorrhizine，berberine and palmatine［μg/(min·cm2)，n=5，±s］

表2 維拉帕米對4種生物堿的腸吸收參數Ka值的影響［μg/(min·cm2)，n=5，±s］Tab.2 Effect of verapamil on Kaof coptisine，jatrorrhizine，berberine and palmatine［μg/(min·cm2)，n=5，±s］

注:與黃連組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

腸段 組別 黃連堿 藥根堿 小檗堿 巴馬汀十二指腸 黃連組 0.993±0.033 0.307±0.009 0.975±0.100 0.430±0.021黃連維拉帕米組 3.017±0.172＊＊ 1.320±0.065＊＊ 4.160±0.253＊＊ 1.480±0.054＊＊空腸 黃連組 1.567±0.074 0.623±0.052 1.854±0.222 0.867±0.024黃連維拉帕米組 2.427±0.108* 1.110±0.064* 2.942±0.322＊＊ 1.200±0.070*回腸 黃連組 0.997±0.012 0.243±0.025 0.752±0.107 0.453±0.021黃連維拉帕米組 2.883±0.155＊＊ 1.227±0.070＊＊ 3.552±0.465＊＊ 1.367±0.069＊＊結腸 黃連組 1.113±0.050 0.553±0.037 1.244±0.042 0.677±0.012黃連維拉帕米組 2.547±0.144＊＊ 0.970±0.051* 2.680±0.362＊＊ 1.050±0.036＊＊

5 討論

腸外翻模型操作簡單、快捷、廉價，技術要求低，保持相對完整的組織和黏膜特性，給出的數據可靠且與體內吸收情況比較相似，腸外翻模型是用來研究藥物吸收機制最為常用的模型之一［8］。

在維拉帕米的作用下，黃連提取物中的黃連堿、藥根堿、小檗堿、巴馬汀在各個腸段的吸收有了明顯提高，說明黃連堿、藥根堿、小檗堿、巴馬汀是P-gp的底物，這與文獻報道一致［9］。

如表2所示，在十二指腸、空腸，葛根提取物也起到類似P-gp抑制劑的作用，使得各生物堿的吸收有了大幅度的提高，這與本課題組前期實驗結果吻合［10］;在回腸和結腸，黃芩提取物使得黃連堿、小檗堿、巴馬汀的吸收有了明顯提高，但提高的程度沒有葛根明顯，這確定了葛根的君藥地位。另有文獻報道黃芩苷是多耐藥相關蛋白2(Mrp2)的底物［11］，也可以起到競爭性抑制作用;由于腸道上除了有P-gp外排蛋白，還有Mrp2外排蛋白、有機陰離子轉運攝取蛋白、溶質轉運攝取蛋白等，出現這種現象可能是各種轉運蛋白一起共同作用的結果，現在對它們的研究比較少，有待進一步進行研究。甘草在各腸段對黃連成分吸收促進均無明顯作用，甚至有減弱的趨勢。葛根為方中的君藥，起到最主要的作用，能大幅提高黃連中的有效成分小檗堿及其衍生物的吸收;黃芩為臣藥，輔佐君藥，進一步增加小檗堿及其衍生物的吸收;甘草為使藥，起到調和諸藥的作用，使其保持在安全的質量濃度范圍。小檗堿及其衍生物是有效成分，具有廣譜的抗菌作用，能用來治療糖尿病，高血脂等［12-13］，同時也是毒性成分［14］，所以保證其在體內的濃度在安全的范圍內顯得尤為重要。根據中醫理論，方中以葛根為主藥，具有解肌透表的作用，黃芩、黃連苦寒，清除里熱，甘草和中安正，解熱毒。諸藥合用共奏解表清里之功，臨床常用用于消化系統、心血管系統疾病，對糖尿病也有很好的效果［15］。各藥協同作用，使方中的有效成分生物堿保持在合適的范圍內，發揮抗菌、降膽固醇及改善葡萄糖耐量的藥理活性作用，輔助全方發揮治療作用。通過觀察不同配伍組的實驗結果，初步嘗試從藥物轉運蛋白的角度來解釋復方配伍的合理性。

表3 4種生物堿在各配伍組各腸段中的Ka值［μg/(min·cm2)，n=5，±s］Tab.3 Kaof coptisine，jatrorrhizine，berberine and palmatine in different groups［μg/(min·cm2)，n=5，±s］

表3 4種生物堿在各配伍組各腸段中的Ka值［μg/(min·cm2)，n=5，±s］Tab.3 Kaof coptisine，jatrorrhizine，berberine and palmatine in different groups［μg/(min·cm2)，n=5，±s］

注:與黃連組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

腸 段 組 別 黃連堿 藥根堿 小檗堿 巴馬汀十二指腸 黃連組 0.993±0.033 0.307±0.009 0.975±0.100 0.430±0.021黃連葛根組 1.453±0.058* 0.573±0.041* 1.644±0.196＊＊ 1.320±0.057＊＊黃連黃芩組 1.047±0.017 0.527±0.012* 1.088±0.134 0.737±0.005*黃連甘草組 1.297±0.033 0.367±0.019 1.172±0.119 0.953±0.042*空腸 黃連組 1.567±0.074 0.623±0.052 1.854±0.222 0.867±0.024黃連葛根組 2.480±0.123* 0.730±0.033* 2.888±0.399＊＊ 2.480±0.062＊＊黃連黃芩組 1.537±0.066 0.603±0.026 1.406±0.174 1.283±0.066*黃連甘草組 1.053±0.033 0.523±0.037 1.062±0.136 0.770±0.014回腸 黃連組 0.997±0.012 0.243±0.025 0.752±0.107 0.453±0.021黃連葛根組 1.043±0.054 0.473±0.034* 0.926±0.148 0.463±0.012黃連黃芩組 1.320±0.024* 0.293±0.012 1.500±0.175＊＊ 1.440±0.033＊＊黃連甘草組 1.087±0.017 0.405±0.039* 0.972±0.184 0.687±0.021結腸 黃連組 1.113±0.050 0.553±0.037 1.244±0.042 0.677±0.012黃連葛根組 0.913±0.029 0.587±0.021 1.104±0.119 0.890±0.094黃連黃芩組 1.563±0.085* 0.540±0.029 1.534±0.184* 1.063±0.025＊＊黃連甘草組 1.327±0.066 0.353±0.025 0.908±0.060 0.563±0.021

腸外翻模型得到的數據與體內吸收最為相似，保持了比較完整的組織和黏膜特性，但是具有同體內一樣的復雜情況，導致數據的解讀難度大。

Caco-2細胞來源于人的直腸癌細胞，結構和功能類似于人小腸上皮細胞，并含有與小腸刷狀緣上皮相關的酶系，細胞亞顯微結構研究表明，Caco-2細胞與人小腸上皮細胞在形態學上相似，具有相同的細胞極性和緊密連接。且Caco-2細胞能特異性的過量表達P-gp外排蛋白，因此，本課題組將采用Caco-2細胞模型進行進一步的研究。

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