大黃酸腸溶緩釋微丸的制備及體外釋放度考察

趙一潔， 張丹參， 張 力， 張夏微， 金 燦

(河北北方學院藥理學教研室，河北張家口 075000)

大黃酸是大黃、蘆薈、虎杖等的主要有效成分之一［1］，屬單蒽核類 1，8－二羥基蒽醌衍生物，其結構式中含有二個羥基和一個羧基，極性較強，具有電化學氧化還原性質［2］。大黃酸在抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、降糖調脂等多方面具有活性［3］，但由于其水溶性差，半衰期短，胃腸刺激大［4－5］等因素，因此限制了其在臨床中的應用發展。海藻酸鈉是一種天然的多糖類高分子化合物，從海藻中提取，有良好的生物相容性和降解性，與大多數多價陽離子反應會形成交聯，形成網狀蛋格結構［6］，廣泛應用于醫藥軟膏基質或混懸劑的增黏劑，尤其在緩釋制劑的片劑、膠囊、微丸、微囊中非常重要［7］。國外對海藻酸鈉在藥劑領域中的應用研究比較活躍［8－10］，海藻酸鈉及其降解產物均無毒，和二價鈣離子在溫和條件下可形成符合多重性能要求的凝膠［11］，其價格便宜，來源豐富，因此廣泛應用于醫學工程。本實驗正是利用海藻酸鈉可與鈣離子形成凝膠微丸的特點，制備大黃酸腸溶凝膠緩釋微丸并對其體外釋放度進行考察。

1 儀器與試藥

Waters 600高效液相色譜儀，2996二極管陣列檢測器，美國Waters公司;BT100－2J蠕動泵，保定蘭格恒流泵有限公司;RC806溶出試驗儀，天大天發科技有限公司制造;85－2A數顯恒溫測速磁力攪拌器，金壇市金南儀器廠;WG—71電熱鼓風干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司;PHS－3C型pH劑，上海精密科學儀器有限公司;大黃酸 (質量分數＞98%)，南京澤朗醫藥科技有限公司;大黃酸對照品 (質量分數＞98%)，中國藥品生物制品檢定所;海藻酸鈉，青島明月海藻集團有限公司;氯化鈣、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀 (KH2PO4)、磷酸氫二鈉 (Na2HPO4·12H2O)、無水甲醇等均為分析純。

2 方法與結果

2.1 空白微丸的制備 配制2.5%的海藻酸鈉溶液放置充分溶脹24 h備用，配制3%的氯化鈣溶液，采用處理過的針頭將溶脹好的海藻酸鈉溶液以適宜的滴速和滴距滴進不斷攪拌的氯化鈣溶液中，骨架微丸立即形成，膠凝2 h［12］后用去離子水沖洗3次，抽濾瓶過濾后放在干燥箱中干燥即得空白微丸。通過對制備工藝的考察，調節各種影響微丸成型性的因素，制得圓整、光滑，成型性最好的微丸。

2.2 大黃酸腸溶緩釋微丸的制備 配制2.5%的海藻酸鈉溶液放置充分溶脹24 h［13］備用，取適量的大黃酸原料放入研缽中，將溶脹好的海藻酸鈉溶液倒入研缽中一部分，充分研磨，將研磨好的大黃酸海藻酸鈉溶液倒入原海藻酸鈉溶液中充分攪拌，使其成為均一分散相。采用處理過的針頭將含藥海藻酸鈉溶液通過蠕動泵以恒定的速度滴入到不斷攪拌的氯化鈣溶液中，骨架微丸立即形成，膠凝2 h后用去離子水洗3次，過濾后放在干燥箱中，調節溫度40℃干燥24 h即得大黃酸微丸。

2.3 大黃酸定量測定方法學考察

2.3.1 溶液的制備 對照品溶液:精密稱取大黃酸對照品1.00 mg置于25 mL量瓶中，用甲醇為溶劑定容到刻度，搖勻得對照品貯備液40 μg/mL。

供試品溶液:稱取適量微丸 (約相當于20 mg大黃酸)，加0.1 mol/L枸櫞酸鈉水溶液適量振搖使之溶解，定容至100 mL，精密吸取5 mL，至100 mL量瓶中，加0.1 mol/L枸櫞酸鈉水溶液稀釋至刻度，搖勻。

2.3.2 色譜條件 Lanbo Kromasil C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇－0.1%磷酸(85∶15)。檢測波長432 nm。體積流量1 mL/min，柱溫25℃，進樣量20 μL。

2.3.3 標準曲線制備 將配制好的對照品溶液分別稀釋成質量濃度為2、4、5、8、10、14 μg/mL的一系列標準品溶液，在上述HPLC條件下測定大黃酸的峰面積。以大黃酸質量濃度 (μg/mL)為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制面積－質量濃度標準曲線，進行回歸分析，求得線性回歸方程Y=62 352X+14 077，r=0.999 0，表明大黃酸在2 ～14 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.3.4 精密度、重復性和穩定性實驗 取10 μg/mL的對照品溶液，按照上述色譜條件測定，連續進樣6次，記錄大黃酸的峰面積，結果RSD為0.08%。取同一批大黃酸微丸，按上述供試品溶液制備方法制備6份溶液，在上述色譜條件下測定大黃酸，計算得大黃酸RSD為1.3%。取同一批大黃酸微丸分別在0、2、4、6、8和10 h進樣，測定大黃酸，計算的大黃酸的RSD為1.9%。

2.3.5 回收率試驗 取處方量輔料于25 mL量瓶中，分別各加入不同質量濃度的大黃酸對照品溶液，定容。用0.45μm微孔濾膜過濾，在上述色譜條件下進行測定，結果平均回收率為96.31%，RSD為3.12%(n=6)結果見表1。

表1 樣品回收率Tab.1 Sample recovery rate

2.3.6 樣品的測定 制備5批樣品，對這5批樣品進行定量測定。以0.1 mol/L枸櫞酸鈉水溶液為空白對照，在上述HPLC條件下進樣，求得峰面積，帶入標準曲線方程，求得大黃酸的量，見表2。空白對照以及樣品的高效液相色色譜圖，見圖1。

2.4 體外釋放度的測定 取大黃酸腸溶微丸 (相當于大黃酸20 mg)，按照《中國藥典》2010年版第二部附錄XD溶出度測定法第一法裝置進行試驗。配制pH 1.2的鹽酸溶液1 000 mL模擬人工胃液作為溶出介質，溫度37℃，轉速100 r/min，在2 h時立即將轉籃升出液面。吸取2.5 mL溶液后將鹽酸溶液棄去，隨即移入預先熱至37℃的pH6.8的磷酸鹽緩沖溶液1 000 mL模擬人工腸液。分別于2、4、6、8、10、12 h時間點吸取溶出液2.5 mL，同時向溶出液中注入2.5 mL磷酸鹽緩沖溶液，吸取出的溶液用0.45 μm微孔濾膜過濾，與5 mL量瓶中用無水甲醇定容，再次過0.45 μm微孔濾膜進樣20 μL，于432 nm處測量峰面積，計算大黃酸微丸的釋放度［14］。

表2 5個批次的藥物中大黃酸質量分數Tab.2 Rhein contents in five batches

圖1 空白對照和微丸的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of blank contrast and the pellets samples

經預實驗，初步確定對微丸成型性和釋放度影響最大的四種因素:海藻酸鈉質量分數 (A)、氯化鈣質量分數 (B)、氯化鈣pH(C)及投藥量(D大黃酸 ∶海藻酸鈉)，分別對微丸釋放度的四因素進行考察，分別見圖2～5。

在各影響因素中選擇形態良好，在胃模擬溶液中藥物釋放較少或幾乎不釋放而在小腸模擬溶液中緩慢釋放的三個水平進行正交試驗。以微丸在小腸模擬溶液中10 h內的釋放度為評價指標，選用L9(34)正交試驗表進行試驗，進一步考察四種因素對微丸形態和釋放度的影響作用，優選制備微丸的工藝條件。正交試驗結果通過制備微丸的形態以及微丸的釋放度兩方面進行綜合評價，其中微丸釋放度是評價的主要因素，兩指標都采用10分制，10分為最好，因此，微丸形態 (D1)從不成型到形態好分為10個等級，用1～10分來評價，小腸模擬溶液釋放度 (D2)=10×微丸釋放度，綜合評分，總分=0.3×D1+0.7×D2。因素水平表見表3，正交試驗結果及方差分析見表4、表5。

圖2 海藻酸鈉質量分數對微丸溶出度的影響Fig.2 Effect of alginate concentration on micropellets's dissolution

圖3 CaCl2質量分數對微丸溶出度的影響FFig.3 Effect of CaCl2concentration on

圖4 CaCl2pH值對微丸溶出度的影響Fig.4 Effect of CaCl2pH on micropellets's dissolution rate

表3 因素水平Tab.3 Factors and levels

表4 正交試驗結果Tab.4 Orthogonal design and experimental results

圖5 投藥量對微丸溶出度的影響Fig.5 Effectofdosage ofrhein on micropellets's dissolution rate

表5 方差分析結果Tab.5 Analysis of variance

極差R的大小反映了各因素對所測定指標的影響，由表4中R可知，四個因素對成丸影響的主次順序為A＞B＞C＞D，即海藻酸鈉質量分數 (A)對微丸的成形性和包封率影響最大，且投藥量(D)的大小對其的影響最小，因此將此列作為誤差列進行方差分析。由表5可知，進一步的方差分析表明海藻酸鈉質量分數 (A)和氯化鈣質量分數(B)二因素均有顯著影響 (P＜0.01)。正交試驗結果顯示，最佳制備工藝為A2B2C2D1，即處方組成為海藻酸鈉2.5%，氯化鈣3%，氯化鈣pH為4，大黃酸 ∶海藻酸鈉為1∶15，凝膠2 h。

按最佳處方制備了5批樣品，對5批樣品分別進行體外釋放度測定，測得微丸在胃模擬溶液中，微丸幾乎不釋放藥物［15］，釋放度均 ＜5%，而在PBS(pH 6.8)小腸模擬溶液中開始緩慢釋放，且8 h釋放大約85%左右的大黃酸，符合緩釋制劑的要求。且5批微丸釋放曲線幾乎重合，沒有顯著性差異，處方工藝重現性良好，釋放曲線見圖6。

圖6 5批微丸的溶出度Fig.6 Five batches pellets'dissolution

3 討論

本實驗利用海藻酸鈉可與二價鈣離子形成難溶性凝膠的性質制備緩釋制劑，海藻酸鈣凝膠微丸的制備方法有很多種，其中應用最多的為滴制法［16－17］。滴制法又分為機械和手工兩種，本實驗采用的是手工滴制法，其中的滴距為8 cm［18］，滴距過小滴出的丸體形狀不一，不圓整規則，滴距過大微丸容易漂浮在氯化鈣液面上，影響微丸的進一步的膠凝反應。采用處理過的針頭做滴管，選取滴管直徑是1.2 mm，滴管直徑過小，由于海藻酸鈉比較黏稠，所以滴制過程比較難進行，滴管直徑過大，滴制出的丸體不圓整，并嚴重拖尾。滴速是30滴/min，滴速過快容易形成串滴，微丸不能形成，滴速過慢影響整批微丸的膠凝反應時間。在微丸膠凝反應完畢后在烘箱里干燥，干燥溫度過高微丸迅速失水導致丸體干燥后不圓整，干燥溫度過低使整個干燥過程時間過渡延長，所以選用40℃，24 h干燥，得粒徑1mm左右的微丸。

影響海藻酸鈣凝膠微丸釋藥行為的因素很多［19］，本實驗對微丸溶出度影響最大的是海藻酸鈉質量分數、氯化鈣質量分數、氯化鈣pH以及投藥量。在預實驗中，海藻酸鈉質量分數低于1%無法滴制成丸，而高于3.5%，滴制過程就很難進行，而且滴制出的微丸拖尾嚴重。氯化鈣的質量分數低于0.5%無法滴制成丸，高于10%滴制出的微丸就漂浮于液面，膠凝過程無法很好完成。由于大黃酸對pH特別敏感，所以氯化鈣溶液的pH值高于7，就會使滴制出的微丸表面被氧化變色，所以氯化鈣的pH值不能高于7。由于大黃酸水溶性很差，幾乎不溶于水，所以投藥量越大，溶出度越小，但是投藥量過大會影響微丸包封率，所以選用與海藻酸鈉的比例為1∶15。

海藻酸鈣凝膠微丸是近年來發展起來的新型劑型，它作為口服藥物的緩控釋載體在國內外已受到廣泛關注［20］。大黃酸在水中的溶解度很低，溶出速率慢以及較強的肝首過效應，使其生物利用度很低［21］，近年來有關海藻酸鈣凝膠微丸作為口服藥物緩釋載體的報道也很多，選擇模型藥物的范圍也很廣，但是海藻酸鈣凝膠微丸尤其適用于難溶性藥物及大分子藥物［22－23］，因此本實驗將大黃酸制備成了海藻酸鈉緩釋微丸，達到了將藥物的緩慢釋放的目的。其能否提高藥物的生物利用度，改善藥物的吸收還有待進一步研究。

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