HPLC法測定鎮痛口服液中2種生物堿類成分

張 浩， 張 慶

(湖北省食品藥品監督檢驗研究院，湖北武漢 430064)

鎮痛口服液處方由洋金花、制草烏、鬧羊花、細辛、姜黃五味藥組成，具有活血通絡、散寒止痛的功效，用于血栓閉塞性脈管炎、肝癌、乳腺癌、胃癌等腫瘤屬寒凝淤滯所致的疼痛。原質量標準為國家藥監局注冊標準WS3-734(Z-138)-2005(Z)，用TLC-SCAN法測定東莨菪堿的量，方法精密度、準確度均較差，無法很好控制產品質量。本實驗采用HPLC法測定洋金花中主要生物堿類成分的量，方法準確，可控性更強。

1 儀器與試藥

Waters e2695-2489高效液相色譜儀、DIONEX U3000高效液相色譜儀、DIONEX P680高效液相色譜儀;Phenomenex Luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、DIONEX Acclaim 120 C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)、依利特 Kromasil C18(250 mm ×4.6 mm，5μm)色譜柱;AG135型電子天平;MS204S/Z型電子天平。氫溴酸東莨菪堿 (批號100049-200308供定量測定用)、硫酸阿托品 (批號100040-200510供定量測定用)，購于中國藥品生物制品檢定所;乙腈、庚烷磺酸鈉為色譜純;甲醇、乙酸鈉、冰醋酸為分析純;水為重蒸水。鎮痛口服液由李時珍醫藥集團有限公司提供，批號:201109001、201109002、201109003。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 參考《中國藥典》2010年版一部洋金花藥材含量測定項下色譜條件［1］，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，選擇相應離子對試劑，進行試驗，結果以乙腈－0.05 mol/L乙酸鈉 (含0.012 5 mol/L庚烷磺酸鈉，用冰醋酸調pH至6.0)(20∶80)為最佳流動相。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 針對生物堿類成分進行提取純化。精密量取本品50 mL，置分液漏斗中，加稀鹽酸調pH值至1～2，搖勻，加三氯甲烷振搖提取3次，每次30 mL，棄去三氯甲烷層，分取酸水層，加氨試液調節pH值9～10，搖勻，加三氯甲烷提取5次，每次30 mL，合并三氯甲烷層，揮干，殘渣加流動相使溶解，轉移至5 mL量瓶中，加流動相至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.2 對照品溶液的制備 取兩種對照品適量，精密稱定，加流動相制成每1 mL含氫溴酸東莨菪堿0.35 mg(折算成東莨菪堿為0.24 mg)、硫酸阿托品90 μg的溶液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 取處方中缺洋金花的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制備陰性樣品溶液。

2.3 方法學驗證

2.3.1 專屬性 取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液，分別依法測定，同時測定相應時間的DAD光譜圖，在該色譜條件下，在與氫溴酸東莨菪堿、硫酸阿托品保留時間相同的位置不出現色譜峰，表明其他成分對兩者測定無干擾，見圖1。

圖1 混合對照品溶液 (A)供試品溶液 (B)與陰性對照溶液 (C)色譜圖Fig.1 HPLC chromotographs of reference substance(A)，sample(B)and solution without scopolamine hydrobromide and atropine sulfate(C)

2.3.2 線性關系考察 取混合對照品溶液，氫溴酸東莨菪堿為0.498 6 mg/mL、硫酸阿托品為0.096 8 mg/mL，分別進樣 1、2、5、10、20 μL，以測得峰面積Y對進樣量X(μg)進行線性回歸。結果表明，氫溴酸東莨菪堿的進樣量在0.498 6～9.297 2μg范圍內，線性關系良好，Y=16 122.6+678 293.7X(r=0.999 9);硫酸阿托品的進樣量在0.096 8～1.936 0 μg范圍內，線性關系良好，Y=33 533.4+826 748.0X(r=0.999 7)。

2.3.3 精密度試驗 精密吸取二者混合對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，在上述色譜條件下重復進樣6次，以氫溴酸東莨菪堿、硫酸阿托品的峰面積計算RSD(n=6)，分別為0.75%、0.89%。結果表明，儀器精密度符合要求。

2.3.4 重復性試驗 分別精密稱取同一批號樣品(批號201109001)適量，共6份，照2.2.1項方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進行分析，東莨菪堿質量濃度為20.29 μg/mL，RSD(n=6)為2.36%、硫酸阿托品質量濃度為6.91 μg/mL，RSD(n=6)為2.23%。結果表明，該方法重復性良好。

2.3.5 回收率試驗 采用加樣回收率法。分別精密量取已知含有量的樣品25 mL(批號201109001，東莨菪堿質量濃度為20.29 μg/mL、硫酸阿托品質量濃度為6.91 μg/mL)，共6份，精密加入氫溴酸東莨菪堿對照品1 mL(0.464 4 mg/mL，折算成東莨菪堿為0.321 4 mg/mL)及硫酸阿托品對照品1 mL(0.242 4 mg/mL)，按2.2.1項操作，測定并計算供試品中東莨菪堿、硫酸阿托品的回收率，結果見表1，可見本法回收率較好。

表1 氫溴酸東莨菪堿與硫酸阿托品回收率試驗結果Tab.1 Results of recoveries for scopolamine hydrobromide and atropine sulfate

2.3.6 穩定性試驗 取同一供試品溶液 (批號201109001)分別于0、2、4、6、8、10 h內進行分析，進樣量10 μL，氫溴酸東莨菪堿、硫酸阿托品峰面積的RSD(n=6)分別為1.77%、1.92%。結果表明供試品溶液在10 h內穩定良好，可滿足檢測時間的需要。

2.3.7 不同色譜柱耐用性 精密稱取同一批號(批號201109001)的樣品，按2.2.1項方法制備供試品溶液，采用DIONEX Acclaim 120 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、依利特 Kromasil C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)、Phenomenex Luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)3種色譜柱在上述色譜條件下進行分析。以氫溴酸東莨菪堿、硫酸阿托品的峰面積計算RSD(n=6)，分別為0.38%、0.56%。結果表明，3種色譜柱測定結果精密度良好。

2.4 樣品測定

用HPLC法測定兩種生物堿，并與原標準采用TLC-SCAN法測定氫溴酸東莨菪堿進行比較。結果見表2。

表2 樣品測定結果 (μg·mL－1)Tab.2 Results of determination by HPLC and TLC scan(μg·mL－1)

3 討論

，氫溴酸東莨菪堿的HPLC流動相，有甲醇-水［2-3］(40∶60，水中含0.02 mol/L 醋酸鈉、0.02%三乙胺、用冰醋酸調pH至6.0)、甲醇-水［4］(含 0.025 mol/L庚烷磺酸鈉及 0.05 mol/L醋酸鈉，以醋酸調pH=4.6)(45∶55)、甲醇-水［5］(53 ∶47，水中含 20 mmol/L 醋酸鈉，0.02%三乙胺，0.3%四氫呋喃，pH為6.86)等，多所選緩沖鹽［6］或離子對系統［7-10］，且對pH均有控制。尚有采用GC法進行測定［11］。本實驗所用流動相系統，所用醋酸鹽及庚烷磺酸鈉，比《中國藥典》2010年版洋金花測定項下磷酸鹽及十二烷基硫酸鈉，更有利于保護色譜柱，并通過實驗確定最佳離子對試劑濃度與適宜pH值。

原標準TLC-SCAN法僅測定氫溴酸東莨菪堿，結果與HPLC法相比相差近30%，且TLC-SCAN法操作過程誤差較大，斑點顯色后不穩定，易褪色，測定波長選擇不合適，故無法控制該產品質量。HPLC法可同時測定該制劑中兩種生物堿類成分的量，方法靈敏準確，可控制性強，完全可替代TLC-SCAN法用于控制該產品質量。

參考文獻:

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:250.

［2］胡奇志，羅興平.華佗止痛擦劑中氫溴酸東莨菪含量測定方法［J］.中華中醫藥雜志，2007，22(9):631-633.

［3］侯士果，谷學新，王書妍，等.HPLC測定洋金花中東莨菪堿和阿托品的含量［J］.中國中藥雜志，2006，31(13):1065-1067.

［4］盧日剛.反相離子對HPLC法測定暈寧貼膏中氫溴酸東莨菪堿的含量［J］.解放軍藥學學報，2004，20(5):341-343.

［5］陸 霞，李 華，阮桂平.心寶丸中硫酸阿托品與氫溴酸東莨菪堿的含量測定［J］.中藥材，2002，25(5):353-354.

［6］侯媛媛，李若潔，彭敏佳，等.HPLC-MS/MS法同時測定華山參滴丸中阿托品、山莨菪堿和東莨菪堿的含量［J］.南開大學學報:自然科學版，2010，43(4):29-35.

［7］孔愛英，張顯杰，陳新善，等.離子對色譜法測定氫溴酸東莨菪堿注射液的含量和降解產物［J］.分析科學學報，2003，19(5):429-430.

［8］朱月琴，張 弦，殷放宙.HPLC法測定洋金花及其總生物堿中東茛菪堿的含量［J］.海峽藥學，2006，18(1):95-97.

［9］卞 俊，蔡定國，顧明娟.反相高效液相色譜法同時測定金馬通絡膠囊中東茛菪堿及士的寧含量［J］.藥物分析雜志，2000，20(1):48-50.

［10］柴金玲，李 瑛，李 偉，等.HPLC法測定洋金花中東莨菪堿的含量［J］.藥物分析雜志，2006，26(5):634-636.

［11］李永慶，趙 文，朱霽虹.毛細管氣相色譜法測定戒毒藥(康靈片)中微量東莨菪堿的含量［J］.藥物分析雜志，1999，19(4):239-241.