雙波長RP-HPLC法同時測定婦科十味片中芍藥苷、阿魏酸

劉亞蓉， 宋 霞， 劉海青

(青海省食品藥品檢驗所，青海西寧 810016)

婦科十味片源于明·張時徹所撰《攝生眾妙方》卷十一之“四制香附丸”，系在“四制香附丸”基礎上加減化裁而來。由香附 (醋炙)、當歸、熟地黃、川芎、延胡索 (醋炙)、白術、赤芍、白芍、大棗、甘草、碳酸鈣組成。現收載于《中國藥典》2010年版。主要功效養血舒肝，調經止痛［1］?！吨袊幍洹分幸陨炙庈諡橹笜藢Π咨?、赤芍進行了定量控制，有文獻報道對婦科十味片中當歸、川芎進行阿魏酸的定量測定［2-5］。本方法在同一色譜條件下同時測定芍藥苷、阿魏酸兩個組分，芍藥苷測定值與《中國藥典》方法芍藥苷測定結果一致。該方法簡便，準確，重復性好，能同時控制婦科十味片處方中四味藥材的兩個組分，能更好地控制該藥品的內在質量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters2695高效液相色譜色譜儀，2487二極管陣列檢測器;Milli-QA超純水器 (Millipore)。

1.2 試藥 芍藥苷對照品 (批號110736-201035，純度96.5%，中國藥品生物制品檢定所)，阿魏酸對照品 (批號110773-200611，中國藥品生物制品檢定所)。乙腈為色譜純，水為重蒸水，其余試劑為分析純。婦科十味片 (收集到5家生產企業共10批樣品)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Sunfire C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);以乙腈為流動相A，以0.1%磷酸溶液為流動相B，按表1中的規定進行梯度洗脫;體積流量1.0 mL/min，柱溫30℃;檢測波長為230 nm(芍藥苷)，310 nm(阿魏酸)。

表1 梯度洗脫時間Tab.1 Mobile phase in gradient elution mode

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取芍藥苷對照品(110736-201035，純度 96.5%)12.12 mg，置 20 mL量瓶中，加50%甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL含芍藥苷0.585 mg的對照品溶液;另精密稱取阿魏酸對照品4.89 mg，置50 mL量瓶中，加50%甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL中含阿魏酸0.097 8 mg的對照品溶液。分別精密兩種對照品溶液各1 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇溶液至刻度，搖勻，得含芍藥苷58.5 μg/mL，阿魏酸9.78 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品制備 取本品20片，精密稱定，研細，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，稱定質量，超聲處理(功率100 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定質量，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按婦科十味片處方及工藝，分別制備缺“白芍、赤芍”和缺“當歸、川芎”的陰性樣品，并按照2.2.2項下方法分別制備兩種陰性樣品溶液。

2.3 專屬性試驗 分別精密吸取供試品溶液、芍藥苷對照品溶液、阿魏酸對照品溶液、缺“白芍、赤芍”和缺“當歸、川芎”的陰性樣品溶液，按2.1項下色譜條件進樣，結果，在供試品溶液色譜圖中，分別有與芍藥苷和阿魏酸保留時間一致的特征峰，且紫外光譜圖與芍藥苷、阿魏酸對照品光譜圖一致。陰性樣品無此特征峰，表明陰性樣品對所測組分無干擾。見圖1、圖2。

2.4 線性關系考察 精密吸取上述芍藥苷、阿魏酸混合對照品溶液 2、4、8、12、16、20 μL，注入液相色譜儀，按2.1項色譜條件進行測定。結果以進樣量為橫坐標，相應峰面積為縱坐標，分別繪制標準曲線，計算回歸方程為芍藥苷Y=532 042X－109.6，r=0.999 9;阿魏酸Y=403 162X+348.3，r=0.999 9。結果表明:芍藥苷在0.117 ～1.170 μg;阿魏酸在 0.0196 ～0.196 μg的范圍內有良好的線性關系。

2.5 精密度試驗 取混合對照品溶液，按2.2.1項下色譜條件下進樣5次，進樣量10 μL，記錄色譜圖，結果芍藥苷、阿魏酸峰面積RSD分別為1.5%、1.3%。

圖1 HPLC色譜圖 (檢測波長230 nm)Fig.1 HPLC chromatograms(detection wavelength 230 nm)

圖2 HPLC色譜圖 (檢測波長310 nm)Fig.2 HPLC chromatograms(detection wavelength 310 nm)

2.6 穩定性試驗 取同一批婦科十味片 (批號1123034)的供試品溶液，在2.2.1項下色譜條件下分別在0、3、6、9、12 h進樣分析，進樣量10 μL，結果芍藥苷、阿魏酸峰面積RSD分別為1.8%、1.1%。表明供試品溶液在12 h內測定基本穩定。

2.7 重復性試驗 精密稱取同一批婦科十味片(批號1123034)樣品6份，分別按2.2.2項制備成供試品溶液，在2.2.1項的色譜條件下進行測定，結果樣品中芍藥苷、阿魏酸質量分數分別為1.23、0.082 mg/g，RSD分別為1.7%、1.6%。

2.8 加樣回收率試驗 稱取已知含有量的婦科十味片樣品 (批號1123034，芍藥苷、阿魏酸質量分數分別為1.23、0.082 mg/g)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，稱取9份，分別加入芍藥苷對照品溶液 (0.585 mg/mL)0.8、1.0、1.2 mL各3份，阿魏酸對照品溶液 (0.097 8 mg/mL)0.4、0.5、0.6 mL各3份，按2.2.2項制備成供試品溶液，在2.2.1項的色譜條件下進行測定，并按上述色譜條件測定芍藥苷、阿魏酸的量，計算回收率。結果表明回收率良好，見表2。

表2 加樣回收率測定結果(n=9)Tab.2 Results of recovery tests(n=9)

2.9 樣品測定 采用上述方法測定來自5家企業的10批樣品，結果見表3。

表3 樣品測定結果(n=4)Tab.3 Determination results of samples(n=4)

3 討論

由于芍藥苷和阿魏酸性質差異較大，為了能使2種組分分離，參照文獻以不同比例的甲醇 －0.1%磷酸溶液、乙腈－0.1%磷酸、乙腈-磷酸鹽緩沖液為流動相進行了考察［6-8］，結果等梯度情況下得不到很好的分離，因此最終確定表1中梯度洗脫，在該洗脫條件下2種組分得到了較好的分離。且采用Zorbax?Extend C18柱、Hypersil ODS2柱進行了驗證，結果均獲得較好的分離。

試驗中根據二極管陣列檢測器所得紫外吸收光譜圖，芍藥苷的最大吸收波長為232 nm，阿魏酸的最大吸收波長為323 nm，二者難以在同一波長處測定，因此參照相關文獻采用雙波長切換法［9-12］，分別選擇2個組分各自的最大吸收波長作為檢測波長進行檢測。

按照《中國藥典》2010年版一部“婦科十味片”【含量測定】項下方法對10批樣品芍藥苷進行了測定，與本實驗測定結果一致。

本實驗結果顯示，對于原標準中已有的定量指標芍藥苷，各生產企業間及企業不同批次間較為穩定、均一。而標準中未控制的定量指標，各企業間差異較大。本方法同時測定婦科十味片中芍藥苷、阿魏酸的量，方法簡便，結果準確，重復性好，為更好的控制其內在質量提供了依據。

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