紅花清肝十三味丸質量標準研究

劉 穎， 胡 琴*， 史文鳳

(1.北京市藥品檢驗所，北京 100035;2.長治醫學院，山西長治 046000)

紅花清肝十三味丸來源于《蒙醫驗方》，1984年收載入《內蒙古蒙成藥標準》，2001年收載入《中華人民共和國衛生部藥品標準》(蒙藥分冊)。原標準收載了顯微鑒別以及兩個理化鑒別［1］。為控制藥品的內在質量，對處方中紅花、丁香、木香、訶子、梔子、紫檀香、人工牛黃進行了薄層色譜鑒別，并采用高效液相色譜法測定了制劑中梔子苷、羥基紅花黃色素A、丁香酚。所建立的方法具有操作簡便、分離效果好、重復性好，專屬性強，準確等優點，可以有效地控制本品的質量。

1 儀器與試藥

島津LC—20A高效液相色譜儀，配備二極管陣列檢測器 (PDA)型;聚酰胺薄膜 (浙江省臺州路橋四甲生化塑料廠);硅膠G預制板 (煙臺市化學工業研究所);硅膠G預制板 (青島海洋化工廠分廠)。

對照品:羥基紅花黃色素A(批號111637-200502)、丁香酚 (批號725-200209)、去氫木香內酯 (批號:111525-200706)、木香烴內酯 (批號:111524-200503)、沒食子酸 (批號:110831-200803)、梔子苷 (批號:110749-200714)、膽酸(批號:100078-200414)、豬去氧膽酸 (批號100087-200610)。對照藥材:紅花 (批號120907-200609)、丁香 (批號121039-200503)，木香 (批號120921-200607)、訶子 (批號121015-200503)。對照品與對照藥材均購于中國食品藥品檢定研究院。

紅花清肝十三味丸樣品共11批:A(批號:20120203);B(批號:110525 071，110526 027);C(批 號:10455001，10455002);D(批 號:110825，110420，110419);E(批 號:110925，111056，110946)。

甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 薄層色譜鑒別

2.1 紅花及羥基紅花黃色素A的薄層鑒別

取本品3 g，研細，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，靜置，取上清液作為供試品溶液。另取不含紅花的陰性制劑，同法制成紅花陰性溶液。另取紅花對照藥材1 g，加甲醇5 mL，超聲處理10 min素A對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取供試品溶液及紅花陰性溶液5 μL，對照藥材溶液 2 μL，對照品溶液 1 μL，點于聚酰胺薄膜上，以醋酸展開，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈 (365 nm)下檢視。供試品在與對照藥材及對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。缺紅花陰性樣品無相應斑點。見圖1。

圖1 紅花清肝十三味丸中紅花及羥基紅花黃色素A的TLC圖譜Fig.1 TLC chromatogram of Carthami Flos and hydroxysafflor yellow A

2.2 丁香及丁香酚、木香及去氫木香內酯的薄層色譜鑒別［2-4］

分別取不含丁香、木香的陰性制劑各3 g，研細，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，靜置，取上清液，分別作為丁香陰性溶液及木香陰性溶液。另取丁香對照藥材、木香對照藥材各1 g，分別加甲醇5 mL，超聲處理10 min，靜置，取上清液作為對照藥材溶液。再取丁香酚對照品、去氫木香內酯對照品，分別加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取2.1項下供試品溶液，丁香陰性溶液、木香陰性溶液及兩種對照藥材溶液各10 μL，兩種對照品溶液各5 μL，點于硅膠 G板上，以環己烷-甲酸乙酯-甲酸 (15∶5∶1)展開，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品在與對照藥材及對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。缺丁香及缺木香陰性樣品無相應斑點。見圖2。

2.3 訶子及沒食子酸的薄層色譜鑒別

圖2 紅花清肝十三味丸中丁香、丁香酚、木香、去氫木香內酯的TLC圖譜Fig.2 TLC chromatogram of Caryophylli Flos，eugenol，Aucklandiae Radix，dehydrocostuslactone

取不含訶子的陰性制劑3 g，研細，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，靜置，取上清液，作為訶子陰性溶液。另取訶子對照藥材1 g，加甲醇5 mL，超聲處理10 min，靜置，取上清液作為對照藥材溶液。再取沒食子酸對照品1 mg，用1 mL甲醇溶解，作為對照品溶液。吸取2.1項下供試品溶液、訶子陰性溶液及對照藥材溶液各10 μL，對照品溶液3 μL，點于硅膠G板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸 (5∶4∶1)展開，噴以2%三氯化鐵乙醇液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品在與對照藥材和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。缺訶子陰性樣品無相應斑點。見圖3。

2.4 梔子苷的薄層色譜鑒別

取不含梔子的陰性制劑3 g，研細，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，靜置，取上清液，作為梔子陰性溶液。另取梔子苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取2.1項下供試品溶液、梔子陰性溶液各10 μL，對照品溶液2 μL，點于硅膠G板上，以乙酸乙酯-丙酮-水(6∶6∶1)展開，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。缺梔子陰性樣品無相應斑點。見圖4。

2.5 紫檀香的薄層色譜鑒別［5-7］

圖3 紅花清肝十三味丸中訶子及沒食子酸的TLC圖譜Fig.3 TLC chromatogram of Chebulae Fructus and gallic acid

圖4 紅花清肝十三味丸中梔子苷的TLC圖譜Fig.4 TLC chromatogram of geniposide

取不含紫檀香的陰性制劑3 g，研細，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，靜置，取上清液，作為紫檀香陰性溶液。另取紫檀香對照藥材1 g，加甲醇5 mL，超聲處理10 min，靜置，取上清液作為對照藥材溶液。吸取2.1項下供試品溶液、紫檀香陰性溶液各10 μL，對照藥材溶液3 μL，點于硅膠G板上，以甲苯-丙酮 (7∶3)展開，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。缺紫檀香陰性樣品無相應斑點。見圖5。

2.6 膽酸、豬去氧膽酸的薄層鑒別

取不含人工牛黃的陰性制劑3 g，研細，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，靜置，取上清液，作為人工牛黃陰性溶液。另取膽酸對照品、豬去氧膽酸對照品，加甲醇制成每1 mL各含1 mg的混合溶液，作為對照品溶液。吸取2.1項下供試品溶液、人工牛黃陰性溶液各10 μL，對照品溶液2 μL，點于硅膠 G板上，以異辛烷-乙酸乙酯-冰醋酸(15∶7∶5)展開，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外燈 (365 nm)下檢視。供試品在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。缺人工牛黃陰性樣品無相應斑點。見圖6。

圖5 紅花清肝十三味丸中紫檀香的TLC圖譜Fig.5 TLC chromatogram of Pterocarpi indici Lignum

圖6 紅花清肝十三味丸中膽酸、豬去氧膽酸的TLC圖譜Fig.6 TLC chromatogram of cholic acid and hyodeoxycholic acid

3 HPLC法測定梔子中梔子苷、紅花中羥基紅花黃色素A、丁香中丁香酚［8-9］

3.1 色譜條件 Phenomenex Luna C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm);以甲醇為流動相A，以0.1%磷酸溶液為流動相B，按表1進行梯度洗脫。柱溫為30℃，檢測波長分別為梔子苷238 nm，羥基紅花黃色素A 403 nm，丁香酚280 nm。理論板數按理論板數按梔子苷峰、羥基紅花黃色素A峰、丁香酚峰計算均應不低于3 000。

表1 梯度洗脫流動相比例Tab.1 Gradient elution ratio using methanol-H2O

3.2 對照品溶液的制備 取梔子苷對照品、羥基紅花黃色素A對照品和丁香酚對照品適量，精密稱定，分別加70%甲醇制成每1 mL含梔子苷20 μg，羥基紅花黃色素 A 25 μg，丁香酚40 μg的溶液，即得。

3.3 供試品溶液的制備 取本品，研細，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，密塞，稱定質量，加熱回流60 min，放冷，再稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

3.4 陰性樣品溶液的制備 分別按處方比例及制劑制備工藝制備不含梔子、紅花、丁香的陰性樣品，再按3.3項下方法制備，即得。

3.5 專屬性試驗 取對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀測定，結果紅花、丁香、梔子陰性樣品分別在羥基紅花黃色素A、丁香酚、梔子苷相應保留時間處未見色譜峰，表明陰性樣品對檢測無干擾。見圖7～9。

3.6 線性關系考察 分別精密吸取梔子苷對照品溶液 (質量濃度為 0.106 5 mg/mL)1、6、12、15、18、21 μL;羥基紅花黃色素 A對照品溶液(質量濃度為 0.064 66 mg/mL)1、3、5、6、8、9、12 μL;丁香酚對照品溶液 (質量濃度為0.227 8 mg/mL)1、5、9、15、18、21 μL，注入高效液相色譜儀，以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，其回歸方程:梔子苷為y=1 444 967.883 12x－8 515.467 88(r=1.000 0)，表明其在0.106 5～2.236 5 μg范圍內線性關系良好;羥基紅花黃色素A為y=2 913 887.269 01x－25 106.472 60(r=0.999 8)，表明其在0.064 66 ～0.775 92 μg范圍內線性關系良好;丁香酚為y=973 750.233 23x+5 538.847 34(r=1.000 0)，表明其在0.227 8～4.783 8 μg范圍內線性關系良好。

3.7 穩定性試驗 取同一份供試品溶液 (批號:20120203)，按3.1項，分別在制備后0、4、8、16、20、24 h進樣測定。結果峰面積RSD梔子苷為0.54%，羥基紅花黃色素A為2.2%，丁香酚為0.73%，表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

3.8 重復性試驗 取本品，研細，取約1 g，精密稱定，依法測定。結果梔子苷RSD為0.73%;羥基紅花黃色素A RSD為1.95%;丁香酚RSD為1.2%，方法重復性良好。

圖7 梔子苷測定HPLC圖譜Tab.7 HPLC chromatograms of geniposide

圖8 羥基紅花黃色素A測定HPLC圖譜Fig.8 HPLC chromatogramsofhydroxysafflor yellow A

圖9 丁香酚測定HPLC圖譜Fig.9 HPLC chromatograms of eugenol

3.9 加樣回收率試驗 精密稱取已知含有量的同一批樣品 (批號20120203，梔子苷含有量為3.881 8 mg/g，羥基紅花黃色素A含有量為3.026 4 mg/g，丁香酚含有量為7.857 0 mg/g)。①低濃度:取約0.25 g精密加入對照品混合溶液 (含梔子苷0.019 915 mg/mL，羥基紅花黃色素A 0.01056mg/mL，丁香酚0.02380 mg/mL)50 mL;②中濃度:取約0.5 g精密加入對照品混合溶液 (含梔子苷0.039 83 mg/mL，羥基紅花黃色素 A 0.021 12 mg/mL，丁香酚0.047 60 mg/mL)50 mL;③高濃度:取約1 g精密加入對照品混合溶液 (含梔子苷0.079 66 mg/mL，羥基紅花黃色素 A 0.042 24 mg/mL，丁香酚0.095 20 mg/mL)50 mL，按供試品溶液同法制備，測定。結果梔子苷平均回收率97.24%，RSD為1.2%;羥基紅花黃色素A平均回收率96.75%，RSD為2.0%;丁香酚平均回收率98.56%，RSD為1.8%。見表2～4。

3.10 樣品測定 按上述測定方法，測定11批紅花清肝十三味丸樣品，結果見表5。

表2 梔子苷加樣回收試驗Tab.2 Results of recovety tests of geniposide

表3 羥基紅花黃色素A加樣回收試驗Tab.3 Results of recovery tests of hydroxysafflor yellow A

表4 丁香酚加樣回收試驗Tab.4 Results of recovery tests of eugenol

4 討論

丁香、丁香酚、木香、去氫木香內酯的薄層鑒別中，曾對木香烴內酯薄層色譜進行了研究，但在其色譜相應位置上，有時空白會有干擾，故僅以木香藥材及去氫木香內酯作為對照。

表5 梔子苷、羥基紅花黃色素A、丁香酚測定結果(n=3)Tab.5 Determination results of geniposide，hydroxysafflor yellow A，eugenol(n=3)

梔子苷的薄層鑒別中，曾對梔子對照藥材薄層色譜進行了研究，通過樣品、梔子苷對照品、梔子對照藥材及空白各色譜的比較，認為梔子的主要鑒別成分為梔子苷，故僅以梔子苷作為對照。

丁香中丁香酚的定量測定采用《中國藥典》2010年版GC的方法，本研究為達到在操作簡便的基礎上得到更多可靠數據的目的，采用了HPLC方法測定丁香酚的量，其最大吸收波長除參考文獻［10-12］外，還采用了PDA檢測器掃描驗證，確定其最大吸收波長為280 nm。

本實驗分別采用不同品牌色譜柱Phenomenex luna C18(5 μm，250 mm ×4.6 mm)，TechMate C18(5 μm，250 mm ×4.6 mm)，Kromasil 100-5C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)進行測定，結果羥基紅花黃色素A、丁香酚、梔子苷峰分別在各種色譜柱均分離良好，空白無干擾，不同色譜柱間測定羥基紅花黃色素A的RSD為1.2%，丁香酚的RSD為2.3%，梔子苷的RSD為2.3%，表明本HPLC方法有較好的耐用性。

根據表5的數據分析，梔子苷含有量數據各廠家、各批次及RSD值差異均較小;羥基紅花黃色素A的含有量測定數據，各廠家之間相差較大，其中廠家C未測出羥基紅花黃色素A，經與企業聯系，認為與其滅菌方法有關，該成分不穩定，不宜采用加熱滅菌的方法;丁香酚含有量測定數據，各廠家、各批次均有一定差異，由于丁香酚為易揮發性成分，有可能與原料、生產、貯藏、運輸等環節有關。除梔子苷、羥基紅花黃色素A、丁香酚3成分外，還對沒食子酸、木香烴內酯、去氫木香內酯進行了研究。但在與沒食子酸相應保留時間處訶子陰性對照有干擾，木香中木香烴內酯、去氫木香內酯峰形均欠佳，故未對這3種成分進一步進行定量測定研究。

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